使い方ガイド
- 回復培養の液量と、そのうち実際に撒いた量を入れます。1 mL で回復培養し 100 µL を撒いたなら、1000 と 100 です。
- サンプルのプレートのコロニー数と、形質転換に入れた DNA 量を入れます。
- コントロールのプレートを置いたなら、その数も入れてください。1枚ごとに、このページが指し示せることが増えます。
- コンピテントセルに表示されている効率を入れると、陽性コントロールがそれと比べられます。
- 下の「この数値が言っていること」を読んでください。どの文にも、その根拠になった数値が入っています。
計算式と注意点
計算がしているのは、数えたプレートにどれだけの DNA が届いたかをたどり直すことだけです。
もとの規模に戻す
数えたのは撒いた分なので、その数を回復培養の全量に戻し、それを DNA で割ります。
- コロニー数の合計
- コロニー数 × (回復培養 ÷ 撒いた量) × 希釈倍率
- 効率
- コロニー数の合計 ÷ (ng ÷ 1000) cfu/µg
各コントロールが確かめるもの
プレートごとに別の段階を切り分けています。コロニーが積み上がったところが、問題のあるところです。
- DNA なし
- 抗生物質・プレート・コンタミ
- 切断のみ
- 消化が不完全
- ベクターのみ
- 自己ライゲーション — 脱リン酸化が必要
- 陽性
- コンピテントセル・ヒートショック
注意点
- 合格の線は引いていません。それを示す1次資料が開けず、作り出すこともしなかったためです。
- かわりにプレートどうしを比べています。「バックグラウンドがサンプルの 60 %」は判定基準ではなく計算であり、拾うコロニーの5個に3個は空である可能性が高い、という意味です。
- 陽性コントロールは、お手元のコンピテントセルに表示されている効率と比べます。その数値はチューブに書かれているものであって、このツールが選んだものではありません。
- 回復培養の液量・撒いた量・希釈倍率は、どのプレートにも同じように適用されます。違った場合は別々に計算してください。
- 数えきれないほど生えたプレートは入れないでください。数えられるものがなければ、推定するよりもっと希釈して撒き直すほうが早道です。
- 効率は形質転換のやり方に大きく左右されます。ヒートショックの長さ、回復培養の時間、プレートの乾き具合などです。同じ細胞でも日によって変わります。
よくある質問
使えますし、効率も出ます。ただ「なぜ何も生えないのか」にはコントロールが要り、それがこのツールをほかの計算ツールと分けているところです。
ベクターのみのライゲーションがいちばん値打ちがあります。自己ライゲーションは最もよくある失敗で、最も静かです。次がリガーゼなしのプレートです。
ライゲーション産物の形質転換効率は、無処理のプラスミドより桁で劣るのがふつうです。このツールがサンプルの絶対値に評価を付けず、陽性コントロールだけをコンピテントセルの表示値と比べているのは、そのためです。
回復培養した菌液を、撒く前にさらに希釈したときです。さらに10倍に希釈したなら 10、追加の希釈がなければ 1 です。