使い方ガイド
- 1 つ目の枠にスタンダードの系列を貼り付けます — 前の列が既知の濃度、後ろの列が吸光度です。0 濃度のスタンダードは外さないでください。それがブランクであり、当てはめが下側のプラトーとして使います。
- 2 つ目の枠に試料を貼り付けます — 名前、吸光度、ウェルに入れる前に希釈したならその希釈倍率。列はタブ・カンマ・スペース 2 つで区切ります。
- 表から濃度を読み取ります。希釈倍率はすでに掛けてあり、ウェル内の濃度がその下に併記されます。
- 表の下の曲線で確かめます。スタンダードは「両端で」線に乗っているはずです。乗っていなければそのプラトーは推測であり、その近くの濃度はすべてその推測を引き継ぎます。
- 「曲線の外」と書かれた行は、あえて数値を出していません。その試料は希釈して測り直してください。
💡 単位は使う人のものです。スタンダードを入れた単位のまま試料が出てきます。
式と注意点
免疫測定は直線では答えません。捕まえるものがない下側は平ら、真ん中は急、抗体が飽和した上側はまた平ら — S 字であり、ここに直線を当てはめると真ん中以外のどこでも外れます。
4 パラメータロジスティックがその S 字を書き下したものです。A は 0 濃度での吸光度、D は飽和での吸光度、C はその中間の濃度、B は C を通るときの急峻さです。
- 検量線
- y = D + (A − D) / (1 + (x / C)^B)
試料を読むのは同じ式を解き直したものです。厳密な式なので、探索も近似もありません。
- 吸光度から濃度へ
- x = C × ( (A − y) / (y − D) )^(1/B)
括弧の中が「正」でなければならず、安全はすべてここから来ます。それが正になるのは、吸光度が A と D の「厳密に」あいだにあるときだけです。その外の吸光度に濃度はありません — 大きくも小さくもなく、ないのです。式は近いプラトーに丸めず、拒みます。
表に出る濃度は元の試料が持っていた濃度なので、希釈倍率が掛け戻されます。
- 希釈があるとき
- 濃度 = x × 希釈倍率
⚠️ 4PL は変曲点について「対称」です。上下の半分の形が本当に違う測定法は 5 パラメータロジスティックで当てはめますが、このツールは用意していません。いつ使うのか誰も分からない 5 つ目のパラメータは、限界をはっきり書いておくより害になります。
実務上の注意
- スタンダードは試料と「同じプレート」で行います。昨日のプレートから持ち越した曲線は、昨日のコーティング・基質・インキュベーションを一緒に持ってきます。
- ブランクを先に引かず、0 濃度のスタンダードとして入れてください。当てはめた下側のプラトーがブランクそのもので、ウェル 1 つではなく系列全体から推定した値です。引いてからプラトーを当てはめると、同じものを 2 回数えることになります。
- 反復ウェルは「別々の行」として入れます。両方のウェルを知っている当てはめのほうが平均だけを知る当てはめより情報が多く、2 行が食い違えばそれ自体を見る価値があります。
- プラトーを越えた吸光度に「濃度はありません」— 大きな値があるのではありません。希釈して測り直してください。希釈倍率の列が答えを元のスケールに戻します。
- 外挿と不可能は違います。最も低いスタンダードより下、最も高いスタンダードより上の濃度は曲線上に「存在」しますが、その位置で測ったスタンダードがないため、その数値は曲線の意見です。
- R² が高いのは曲線が点の近くを通るという意味です。プラトーに「届いたか」は何も言わず、逆算が割り算するのはまさにプラトーまでの距離です。
よくある質問
その吸光度が 2 つのプラトーのどちらかを越えたからです。上を越えれば抗体が飽和して、そこから上はどの濃度でも同じ値になります。下を越えれば空のウェルより信号が低いということです。どちらの場合も曲線が渡せる濃度はなく、曲線が持っている「いちばん近い」濃度を代わりに出すのは数値をでっち上げることです。希釈して測り直してください。
いいえ。ブランクは 0 濃度のスタンダードとして入れてください。当てはめが見つける下側のプラトーがブランクそのもので、ウェル 1 つではなく系列全体から推定した値です。先に引いてからプラトーを当てはめると、同じものを 2 回数えることになります。
最低 5 点です。パラメータが 4 つあるため、それより少ないと定まりません。実際には 2〜3 桁の範囲にわたって 7〜8 点あると、両方のプラトーが外挿ではなく「実測」になります。
スタンダードを入れた単位そのままです。このツールは単位を換算も推測もしません — pg/mL で入れれば pg/mL で出ます。
あちらは「直線」を当てはめます。狭い範囲のタンパク質定量のように、反応が本当に比例するときに正しい道具です。こちらは免疫測定が全範囲で描く S 字の 4 パラメータロジスティックを当てはめます。ELISA に直線を使うことこそ、自分のスタンダード系列の上下を捨てる羽目になる理由です。
そうとは限りません。R² は点が線にどれだけ近いかを測りますが、逆算が割り算するのは「プラトーまでの距離」です。飽和に届かなかった系列でもきれいに当てはまることがあり、そのとき上側のプラトーはデータが見たことのない場所で、上のほうの濃度はすべてそれを引き継ぎます。図の「両端」でスタンダードが平らになっているかを見てください。
使えます。変えるものはありません。向きは当てはめがスタンダード自身から見つけ、2 つのプラトーは意味を保ちます — 0 濃度のプラトーは、その値が高くても低くても 0 濃度のプラトーです。