使い方ガイド
- プーリングの方式を選びます。迷うときの既定は等モルです。
- 表計算ソフトから3列 — 名前・長さ (bp)・濃度 (ng/µL) — をコピーして欄に貼り付けます。重み付けの場合は、4列目に比を足してください。
- 目標のプール濃度 (nM) と最終体積 (µL) を入れます。シーケンサーとライブラリー調製キットが求める値をお使いください。
- 1 bp あたりの分子量は既定で 660 です。キットや所属機関の基準が 650 なら、そちらに変えてください。
- 正確にピペットできる最小の量を、最小量の欄に入れてください。それを下回るものには表で印が付きます。
- 表の上から順に、示された量を各ライブラリーから取り、最後に緩衝液を加えて最終体積にします。
計算式と注意点
4つの方式が違うのは1点だけ — 各ライブラリーがプールの分子のうちどれだけを出すかです。その取り分が決まれば、あとの計算は同じです。
濃度からモル濃度へ
ng/µL は質量濃度なので、そのまま足せません。同じ ng/µL でも、長さが2倍のライブラリーは分子の数が半分です。
- モル濃度 (nM)
- ng/µL × 10⁶ ÷ (長さ bp × 1 bp あたりの分子量)
- 例：1 kb · 1 ng/µL · 660
- 1 × 10⁶ ÷ (1000 × 660) ≈ 1.515 nM
取る量
ライブラリー i がプールの分子のうち wᵢ の取り分を出すとすると、量は次のように決まります。
- 取る量 (µL)
- vᵢ = wᵢ × 目標 × 最終体積 ÷ モル濃度ᵢ
- 緩衝液 (µL)
- 最終体積 − Σvᵢ
方式ごとの取り分 wᵢ
| 方式 | wᵢ | 結果 |
|---|---|---|
| 等モル | 1/n | どのライブラリーも同じ分子数を出す |
| 等量 | モル濃度ᵢ ÷ Σ モル濃度 | どのチューブからも取る量が同じになる |
| 重み付け | 比ᵢ ÷ Σ 比 | 分子が指定した比で分かれる |
| 希釈してから等量 | 1/n（希釈後） | すべてが1つの濃度になるため、等モルと等量が一致する |
届く上限の濃度
上限は、取る量がちょうど最終体積を満たす点 — 緩衝液が0になる点です。この組み合わせから、それより濃いものは作れません。
- 目標の上限 (nM)
- 1 ÷ Σ(wᵢ ÷ モル濃度ᵢ)
- 等モル
- モル濃度の調和平均
- 等量
- モル濃度の算術平均
注意点
- 1 bp あたり 660 g/mol は NGS の慣習です。二本鎖DNA 一般には 650 が広く使われており、2つは約 1.5% 違います。所属機関の基準があればそれに従ってください。このサイトの ng ↔ pmol 換算ツールは既定が 650 です。
- 長さは、アダプターを含めた最終的なライブラリーの長さです。インサートの長さだけを入れると、モル濃度が高く出ます。
- この計算は、どのライブラリーも無傷の二本鎖DNA であることを前提としています。アダプターダイマーや断片は蛍光法の測定値を押し上げるため、実際のクラスター数は計算より少なくなります。リアルタイムPCR による定量のほうが、その影響を受けにくくなります。
- 上限が調和平均であるため、とても薄いライブラリーが1つあるだけで全体が引き下げられます。目標に届かないときは、まずそこを見てください。
- このツールは報告するだけで、直しはしません。ライブラリーを外したり目標を下げたりを勝手に行うことはありません。どのライブラリーが大事かは、使う人にしか分からないからです。
- 液量は小数第2位まで表示します。計算自体は丸めておらず、丸めは表示の段階だけです。
よくある質問
リード数を均等に分けたいなら等モルです。濃度がすでに近く、操作を減らしたいなら等量でかまいません。あるライブラリーだけ多くリードが必要なら重み付けです。1つのライブラリーだけがとても濃く、等モルだと1 µL 未満を取ることになる場合は、希釈してからプールしてください。
NGS の慣習は 660 なので、ここでの既定は 660 です。二本鎖DNA 一般には 650 が広く使われています。2つの差は約 1.5% で判断が変わることはまれですが、キットの添付文書や所属機関の基準が値を挙げているなら、そちらに従ってください。
そのライブラリーがほかよりずっと濃いため、ごく少量で取り分が足りてしまうということです。先に希釈するか、最終体積を大きくするか、希釈してからプールする方式をお使いください。このツールが代わりに選ぶことはしません。
取れるだけ取っても、その濃度では最終体積に収まらないということです。この組み合わせで届く上限を横に表示しますので、それ以下を狙うか、いちばん薄いライブラリーを濃縮するか、最終体積を小さくしてください。
段階が2つあり、制約も2組あるからです。希釈の段階で取る原液が少なすぎる場合と、プールの段階で取る量が少なすぎる — あるいは存在する量を超える — 場合とでは、直し方が違います。前者は希釈後の液量を大きくすること、後者は目標か最終体積を調整することです。
どこへも行きません。すべてブラウザの中で計算され、入力したものは保存されません。