使い方ガイド
- ベクターの長さと濃度、そして反応に入れる量を入れます。
- 組み立て方を選びます。インサート1つなら既定は 3 : 1、断片が複数なら既定は等モルです。
- インサートを1行につき1つ貼り付けます。4つ目のセルを足すと、その行だけ別のモル比にできます。
- 反応液量・緩衝液の倍率・リガーゼの液量を確かめます。既定は 20 µL・10×・1 µL です。
- 表の順にピペットで入れます。水がいちばん多いので先に、リガーゼは最後です。
計算式と注意点
モル比をそろえるのは1回の割り算です。あとはチューブを満たすだけです。
質量からモル数へ
塩基対には平均の質量があるため、長さと質量が決まれば量が決まります。このサイトの ng ↔ pmol 換算ツールと同じ平均値を使っています。
- pmol
- ng × 1000 / (bp × 650)
- 1 pmol の質量
- bp × 650 / 1000 ng
インサートをどれだけ入れるか
インサートの量はベクターの量にモル比を掛けたもので、それを質量に、さらに液量に戻します。
- インサートの pmol
- ベクターの pmol × 比
- インサートの ng
- インサートの pmol × 長さ × 650 / 1000
- インサートの µL
- インサートの ng ÷ 濃度
チューブを満たす
緩衝液の液量は表から引くのではなく導きます。10× の緩衝液は10分の1で 1× になります。
- 緩衝液の µL
- 反応液量 ÷ 緩衝液の倍率
- 水の µL
- 反応液量 − DNA − 緩衝液 − リガーゼ
注意点
- 水が負になるときは、超えた量だけを表示してほかは出しません。DNA が薄いときに起こり、ベクターを減らすのがいちばん簡単な対処です。
- 3 : 1 は、インサートがベクターより小さい通常のクローニングでの出発点です (Addgene)。大きいインサートや平滑末端では、いくつかの比を並行して試すのが普通です。
- 断片が複数の組み立ては等モルから始めます。Addgene は、1反応で5個を超えると成功率が急に下がるのを見ている実験室がある、と注記しています。
- 塩基対あたり 650 g/mol は平均値です。短い断片ではそこから外れ、その誤差はそのままモル比に入ります。
- リガーゼは最後に加え、ボルテックスしないでください。グリセロールに入っているため層になります。ピペットで静かに混ぜてください。
- このツールが計算するのは何をどれだけ入れるかまでです。温度・時間・平滑末端の扱いは、お使いの酵素の説明書に従ってください。
よくある質問
インサート3に対してベクター1です。質量比ではなくモル比なので、ベクターより短いインサートはベクターより少ない ng で入ります。pmol の列を見れば比がそのまま分かります。
DNA の液量だけですでに反応液量を超えています。ベクターを減らすのがいちばん簡単でたいてい足ります。それでだめなら、反応の規模を大きくするか DNA を濃縮してください。
組み立て方をインサート複数に切り替え、1行につき1つ並べてください。既定は等モルです。行の4つ目のセルで、その断片だけ別の比にできます。
緩衝液の倍率の欄に 5 と入れてください。20 µL の反応なら 4 µL になります。液量は表から引くのではなく倍率から計算しています。
参考文献
反応組成と既定値の出どころです。ng ↔ pmol の算術は定義で、塩基対あたりの平均分子量は ng ↔ pmol 変換ツールの値をそのまま使っています。
- Addgene. Protocol — DNA Ligation (How to Ligate Plasmid DNA). Read 2026-08-21.https://www.addgene.org/protocols/dna-ligation/10 µL 反応の組成（10× 緩衝液 1 µL または 5× 緩衝液 2 µL・T4 リガーゼ 0.5–1 µL・水で 10 µL）、標準クローニングのインサート : ベクター = 3 : 1、総 DNA 約 100 ng
- Addgene. Protocol — Gibson Assembly. Read 2026-08-21.https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/複数断片をつなぐときの等モル既定値（「断片が等モルのとき収率が最も良い」）と、5断片を超えると成功率が急に下がるという観察の警告
NEB のプロトコルページはこの値を転記した時点では開けず（ボット確認画面）、使っていません。Golden Gate 専用の文書は入手できなかったため、等モル既定値の根拠は Gibson の文書1つです。