使い方ガイド
- ブロックごとに数えた細胞数を入れます。カンマ・空白・改行で区切るか、表計算ソフトからそのまま貼り付けてください。
- 希釈倍率を入れます。既定は 1 です。トリパンブルーと 1:1 で混ぜた場合は 2 と入れてください。
- cells/mL が大きく表示され、その横に平均個数と数えたブロック数が出ます。
- 死細胞数を足すと、生存率が計算されます。（任意）
- 懸濁液の総量を足すと、総細胞数が計算されます。（任意）
- 必要な細胞数を足すと、取るべき量が出ます。（任意）
💡 指数は e で入力できます。たとえば 1.5×10⁻⁵ は 1.5e-5 と入力します。
細胞数計測の計算式と注意点
血球計算盤は、容積が正確に分かっているごく小さな部屋です。その中の細胞を数えれば、濃度が分かります。
標準的な血球計算盤の1ブロックは 1 mm 四方で、その上 0.1 mm のところにカバーガラスが載ります。
- 1ブロックの上の容積
- 1 mm × 1 mm × 0.1 mm = 0.1 mm³ = 0.1 μL = 10⁻⁴ mL
つまり1ブロックで数えた細胞は 10⁻⁴ mL の中の細胞であり、これを1 mL あたりの濃度にするには 10⁴ を掛けます。
- 濃度
- cells/mL = 1ブロックあたりの平均個数 × 希釈倍率 × 10⁴
10⁴ は計算盤の寸法から出てくる数です。任意に決めた定数ではありません。
あとはそこから続きます。
- 総細胞数
- 総細胞数 = cells/mL × 液量(mL)
- 生存率
- 生存率(%) = 生細胞 ÷ (生細胞 + 死細胞) × 100
- 取る量
- 液量 = 必要な細胞数 ÷ cells/mL
注意点
- 希釈倍率の既定は 1 です。トリパンブルーと 1:1 で混ぜたなら、必ず 2 に変えてください。そのままにすると、計数値が本当の値の半分になります。誤った細胞数は見た目には誤って見えないため、この間違いはずっとあとになって表に出がちです。
- 1ブロックあたり 20〜250 個を数えるのが通常の運用です。少なすぎると偶然に左右され、多すぎると重なって見落とされます。この範囲を外れたら、試料を希釈するか濃縮して数え直してください。
- 線の上に乗った細胞をどう扱うか、規則を決めて守ってください。よく使われるのは、上と左の線に触れた細胞は数え、下と右は数えないという規則です。人によって規則が違うと結果が食い違います。
- 入れる前によく混ぜてください。細胞は沈みます。ピペットで静かに数回混ぜ、すぐに入れてください。
- トリパンブルーは、時間が経てば生細胞も染めます。混ぜてから3〜5分以内に数えてください。長く置くと、生存率が実際より低く出ます。
- 細胞が塊になっていると数えにくくなります。数える前に単一細胞まで分散させ、塊を1個と数えるのかその細胞数で数えるのかを、あらかじめ決めておいてください。
- 複数のブロックを数えるのは、平均を取るためです。四隅の4ブロックを選ぶのが通常です。ブロック間のばらつきが大きい場合は、混ぜ方か分散が足りていません。
よくある質問
希釈していなければ 1 です。トリパンブルーと 1:1 で混ぜたなら 2 です。細胞懸濁液 10 μL にトリパンブルー 90 μL を加えたなら 10 です。これを入れ忘れると、結果はちょうどその倍率のぶんだけ低く出ます。
1ブロックが 10⁻⁴ mL だからです。1 mm 四方で深さが 0.1 mm、つまり 0.1 μL、つまり 10⁻⁴ mL です。この数は計算盤の寸法から出ています。
通常は四隅の4ブロックです。数を増やすほど平均は安定しますが、時間もかかります。ブロック間で値が大きく違うのは、混ぜ方か分散に問題があるしるしです。
250 個を超えると重なって見落としやすくなります。試料をさらに希釈して数え直し、希釈倍率もそれに合わせて上げてください。
20 個を下回ると、結果が偶然に左右されます。試料を濃縮するか、数えるブロックを増やして平均を安定させてください。
唯一の正解はありません。大切なのは規則を1つ決めて守ることです。よく使われるのは、上と左の縁は数え、下と右は数えないという規則です。こうすれば、二重に数えることも見落とすこともありません。
本当に低いこともありますが、トリパンブルーは生細胞も、その中に置かれていれば染めます。混ぜてから3〜5分以内に数えたかを確かめてください。
必要な細胞数を入れると、取るべき量が出ます。たとえば 1.72 × 10⁶ cells/mL の懸濁液から 5 × 10⁵ 個を取るなら、およそ 291 μL です。
数える方法が違うため、ある程度の差は想定されます。自動の装置は塊やごみの扱いが違い、判定の拠りどころも違います。ひとつの方法で一貫して測り、どの方法で測ったかを記録するほうが確実です。