사용 방법
- 풀링 방식을 선택합니다. 판단이 어려우면 「등몰」이 기본입니다.
- 엑셀에서 「이름 · 길이(bp) · 농도(ng/µL)」 세 열을 복사해 입력창에 붙여넣습니다. 「가중」을 선택했다면 비율 열을 하나 더 추가합니다.
- 목표 풀 농도(nM)와 최종 부피(µL)를 입력합니다. 시퀀서와 라이브러리 키트가 요구하는 값을 그대로 사용하면 됩니다.
- bp당 분자량은 660이 기본값입니다. 사용하는 키트나 사내 기준이 650이면 변경해 입력하세요.
- 최소 분주 부피에 피펫으로 정확히 취할 수 있는 최소량을 입력합니다. 그보다 적게 취해야 하는 계획이 산출되면 표에 표시됩니다.
- 표에 따라 각 라이브러리에서 취하고, 마지막에 버퍼를 추가해 최종 부피를 맞춥니다.
공식과 주의사항
네 방식은 「각 라이브러리가 풀의 분자 수 중 얼마를 차지하는가」 하나만 다릅니다. 그 비중을 정하고 나면 계산은 동일합니다.
농도를 몰농도로
ng/µL은 질량 농도라 그대로 합산할 수 없습니다. 동일한 ng/µL이라도 길이가 2배면 분자 수는 절반이기 때문입니다.
- 몰농도 (nM)
- 농도(ng/µL) × 10⁶ ÷ (길이(bp) × bp당 분자량)
- 예: 1 kb · 1 ng/µL · 660
- 1 × 10⁶ ÷ (1000 × 660) ≈ 1.515 nM
분주 부피
라이브러리 i가 풀의 분자 수 중 wᵢ만큼을 차지한다고 하면, 취할 양은 다음과 같습니다.
- 취할 양 (µL)
- vᵢ = wᵢ × 목표농도 × 최종부피 ÷ 몰농도ᵢ
- 버퍼 (µL)
- 최종부피 − Σvᵢ
방식별 몫 wᵢ
| 방식 | wᵢ | 결과 |
|---|---|---|
| 등몰 | 1/n | 모든 라이브러리가 동일한 분자 수를 제공 |
| 등량 | 몰농도ᵢ ÷ Σ몰농도 | 모든 튜브에서 취할 양이 동일해짐 |
| 가중 | 비율ᵢ ÷ Σ비율 | 지정한 비율대로 분자 수가 배분됨 |
| 희석 후 등량 | 1/n (희석 뒤) | 모두 동일한 농도가 되어 등몰과 등량이 일치함 |
가능한 최대 농도
취할 양의 합이 최종 부피와 같아지는 지점이 한계입니다. 버퍼가 0이 되는 지점이며, 그보다 높은 목표는 이 세트로 조제할 수 없습니다.
- 최대 목표 농도 (nM)
- 1 ÷ Σ(wᵢ ÷ 몰농도ᵢ)
- 등몰일 때
- 몰농도들의 조화평균
- 등량일 때
- 몰농도들의 산술평균
주의사항
- bp당 분자량 660은 NGS의 관행값입니다. dsDNA 일반에는 650도 널리 사용되며 두 값의 차이는 약 1.5 %입니다. 사내 기준이 있으면 그것을 따르세요. 이 사이트의 ng ↔ pmol 변환기는 650을 기본값으로 사용합니다.
- 길이는 어댑터까지 포함한 최종 라이브러리 길이입니다. 인서트 길이만 입력하면 몰농도가 실제보다 높게 산출됩니다.
- 이 계산은 라이브러리가 전부 온전한 이중가닥이라고 가정합니다. 어댑터 이량체나 절단된 단편이 혼입되면 형광 정량값이 과대평가되고, 실제 클러스터 수는 계산값보다 적게 나옵니다. qPCR 정량이 이 문제에 더 강건합니다.
- 조화평균이므로 가장 묽은 라이브러리 하나가 최대 농도를 제한합니다. 목표에 미달하면 그 샘플부터 확인하세요.
- 이 도구는 안내만 하고 자동으로 수정하지 않습니다. 샘플을 제외하거나 목표를 낮추는 판단은 하지 않습니다. 어느 라이브러리가 중요한지는 사용자가 판단할 영역입니다.
- 표시되는 부피는 소수 둘째 자리까지입니다. 계산 자체는 반올림 없이 수행되며, 반올림은 화면 표시 시에만 적용됩니다.
자주 묻는 질문
리드를 고르게 배분하려면 「등몰」입니다. 농도가 서로 비슷하고 조작을 줄이려면 「등량」으로도 충분합니다. 특정 라이브러리에 리드를 더 배정하려면 「가중」, 농도가 매우 높은 라이브러리 때문에 극소량을 취해야 하는 상황이면 「희석 후 등량」입니다.
NGS의 관행이 660이라 기본값으로 설정했습니다. dsDNA 일반 계산에는 650도 널리 사용됩니다. 두 값의 차이는 약 1.5 %라 대개 결과를 뒤집지 않지만, 사내 기준이나 키트 설명서에 명시된 값이 있으면 그것을 따르는 편이 좋습니다.
해당 라이브러리가 다른 것보다 훨씬 농도가 높아 극소량만 취해도 필요량이 충족된다는 뜻입니다. 그 라이브러리를 먼저 희석하거나, 최종 부피를 늘리거나, 「희석 후 등량」 방식을 사용하면 됩니다. 이 도구가 대신 결정하지는 않습니다.
취할 양을 모두 합해도 최종 부피 안에서 그 농도에 도달하지 못한다는 뜻입니다. 화면에 「이 세트로 가능한 최대 농도」가 함께 표시되니 그 값을 기준으로 목표를 정하거나, 가장 묽은 라이브러리를 농축하거나, 최종 부피를 줄이세요.
단계가 둘이고 제약도 둘이기 때문입니다. 희석 시 원액을 지나치게 소량 취해야 하는 문제와, 풀링 시 희석액을 지나치게 소량(또는 보유량보다 많이) 취해야 하는 문제는 해결 방법이 다릅니다. 전자는 희석 후 부피를 늘려서, 후자는 목표 농도나 최종 부피를 조정해 해결합니다.
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