사용 방법
- 풀링 방식을 고릅니다. 잘 모르겠으면 「등몰」이 기본입니다.
- 엑셀에서 「이름 · 길이(bp) · 농도(ng/µL)」 세 열을 복사해 상자에 붙여넣습니다. 「가중」을 골랐다면 비율 열을 하나 더 붙입니다.
- 목표 풀 농도(nM)와 최종 부피(µL)를 넣습니다. 시퀀서와 라이브러리 키트가 요구하는 값을 그대로 쓰면 됩니다.
- bp당 분자량은 660 이 기본입니다. 쓰는 키트나 사내 기준이 650 이면 바꿔 넣으세요.
- 최소 분주 부피에 파이펫으로 정확히 뜰 수 있는 최소량을 넣습니다. 그보다 적게 뜨라는 계획이 나오면 표에 표시됩니다.
- 표대로 각 라이브러리에서 뜨고, 마지막에 버퍼를 더해 최종 부피를 맞춥니다.
공식과 주의사항
네 방식은 「각 라이브러리가 풀의 분자 수 중 얼마를 대는가」 하나만 다릅니다. 그 몫을 정하고 나면 계산은 같습니다.
농도를 몰농도로
ng/µL 은 질량 농도라 그대로 더할 수 없습니다. 같은 ng/µL 이라도 길이가 두 배면 분자 수는 절반이기 때문입니다.
- 몰농도 (nM)
- 농도(ng/µL) × 10⁶ ÷ (길이(bp) × bp당 분자량)
- 예: 1 kb · 1 ng/µL · 660
- 1 × 10⁶ ÷ (1000 × 660) ≈ 1.515 nM
분주 부피
라이브러리 i 가 풀의 분자 수 중 wᵢ 만큼을 댄다고 하면, 뜰 양은 다음과 같습니다.
- 뜰 양 (µL)
- vᵢ = wᵢ × 목표농도 × 최종부피 ÷ 몰농도ᵢ
- 버퍼 (µL)
- 최종부피 − Σvᵢ
방식별 몫 wᵢ
| 방식 | wᵢ | 결과 |
|---|---|---|
| 등몰 | 1/n | 모든 라이브러리가 같은 분자 수를 낸다 |
| 등량 | 몰농도ᵢ ÷ Σ몰농도 | 모든 튜브에서 뜰 양이 같아진다 |
| 가중 | 비율ᵢ ÷ Σ비율 | 지정한 비대로 분자 수가 나뉜다 |
| 희석 후 등량 | 1/n (희석 뒤) | 모두 같은 농도가 되어 등몰과 등량이 같아진다 |
가능한 최대 농도
뜰 양을 다 더한 것이 최종 부피와 같아지는 지점이 한계입니다. 버퍼가 0 이 되는 자리이고, 그보다 높은 목표는 이 세트로 만들 수 없습니다.
- 최대 목표 농도 (nM)
- 1 ÷ Σ(wᵢ ÷ 몰농도ᵢ)
- 등몰일 때
- 몰농도들의 조화평균
- 등량일 때
- 몰농도들의 산술평균
주의사항
- bp당 분자량 660 은 NGS 관행값입니다. dsDNA 일반에는 650 도 널리 쓰이며 두 값의 차이는 약 1.5% 입니다 — 사내 기준이 있으면 그것을 따르세요. 이 사이트의 ng ↔ pmol 변환기는 650 을 기본으로 씁니다.
- 길이는 어댑터까지 포함한 최종 라이브러리 길이입니다. 인서트 길이만 넣으면 몰농도가 실제보다 높게 나옵니다.
- 이 계산은 라이브러리가 전부 온전한 이중가닥이라고 봅니다. 어댑터 이량체나 잘린 조각이 섞여 있으면 형광 정량값이 부풀고, 실제 클러스터 수는 계산보다 적게 나옵니다. qPCR 정량이 이 문제에 강합니다.
- 조화평균이라 가장 묽은 라이브러리 하나가 최대 농도를 끌어내립니다. 목표에 못 미치면 그 샘플부터 보세요.
- 이 도구는 알리기만 하고 고치지 않습니다. 샘플을 빼거나 목표를 낮추는 판단은 하지 않습니다 — 어느 라이브러리가 중요한지는 사람이 압니다.
- 표시되는 부피는 소수 두 자리까지입니다. 계산 자체는 반올림 없이 이루어지고, 반올림은 화면에 찍을 때만 합니다.
자주 묻는 질문
리드가 고르게 나뉘길 바라면 「등몰」입니다. 농도가 서로 비슷하고 손을 덜 쓰고 싶으면 「등량」도 충분합니다. 어떤 라이브러리에 리드를 더 주고 싶으면 「가중」, 아주 진한 라이브러리 때문에 극소량을 떠야 하는 상황이면 「희석 후 등량」입니다.
NGS 쪽 관행은 660 이라 기본값으로 두었습니다. dsDNA 일반 계산에는 650 도 널리 쓰입니다. 두 값의 차이는 약 1.5% 라 대개 결과를 뒤집지 않지만, 사내 기준이나 키트 설명서에 적힌 값이 있으면 그것을 따르는 편이 낫습니다.
그 라이브러리가 다른 것보다 훨씬 진해서 아주 조금만 떠도 몫이 채워진다는 뜻입니다. 그 라이브러리를 먼저 희석해 두거나, 최종 부피를 키우거나, 「희석 후 등량」 방식을 쓰면 됩니다. 이 도구가 대신 정하지는 않습니다.
뜰 양을 다 더해도 최종 부피 안에서 그 농도가 안 나온다는 뜻입니다. 화면에 「이 세트로 가능한 최대 농도」가 함께 나오니 그 값을 보고 목표를 정하거나, 가장 묽은 라이브러리를 농축하거나, 최종 부피를 줄이세요.
단계가 둘이고 제약도 둘이기 때문입니다. 희석할 때 원액을 너무 조금 떠야 하는 것과, 풀링할 때 희석액을 너무 조금(또는 있는 것보다 많이) 떠야 하는 것은 고치는 방법이 다릅니다. 앞은 희석 후 부피를 키워서, 뒤는 목표나 최종 부피를 손봐서 풉니다.
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