Cómo se usa
- Elige una estrategia de pooling. Si dudas, la equimolar es la opción por defecto.
- Copia tres columnas —nombre, longitud (bp), concentración (ng/µL)— de una hoja de cálculo y pégalas en el recuadro. Para el pooling ponderado, añade una cuarta columna de proporciones.
- Introduce la concentración objetivo del pool (nM) y el volumen final (µL). Usa lo que pidan el secuenciador y el kit de libraries.
- El peso molecular por bp es 660 por defecto. Cámbialo si tu kit o la norma de tu laboratorio dicen 650.
- Pon en el campo de volumen mínimo el volumen más pequeño que puedas pipetear con exactitud. Todo lo que quede por debajo se marca en la tabla.
- Recorre la tabla tomando de cada library el volumen indicado y añade después amortiguador hasta llegar al volumen final.
Fórmulas y advertencias
Las cuatro estrategias se diferencian en una sola cosa: qué parte de las moléculas del pool aporta cada library. Una vez fijada esa parte, la aritmética es la misma.
De concentración a molaridad
ng/µL es una concentración másica y no se puede sumar directamente: a los mismos ng/µL, una library el doble de larga tiene la mitad de moléculas.
- Molaridad (nM)
- ng/µL × 10⁶ ÷ (longitud en bp × PM por bp)
- p. ej. 1 kb · 1 ng/µL · 660
- 1 × 10⁶ ÷ (1000 × 660) ≈ 1.515 nM
Volumen que hay que tomar
Si la library i aporta una parte wᵢ de las moléculas del pool, el volumen se deduce sin más.
- Volumen (µL)
- vᵢ = wᵢ × objetivo × volumen final ÷ molaridadᵢ
- Amortiguador (µL)
- volumen final − Σvᵢ
La parte wᵢ en cada estrategia
| Estrategia | wᵢ | Resultado |
|---|---|---|
| Equimolar | 1/n | cada library aporta el mismo número de moléculas |
| Volumen igual | molaridadᵢ ÷ Σ molaridad | de cada tubo se toma el mismo volumen |
| Ponderado | proporciónᵢ ÷ Σ proporción | las moléculas se reparten en la proporción indicada |
| Diluir y luego volumen igual | 1/n (tras la dilución) | todo está a una misma concentración, así que equimolar y volumen igual coinciden |
Concentración más alta alcanzable
El techo es el punto en el que los volúmenes llenan exactamente el volumen final, es decir, donde el amortiguador llega a cero. Con este conjunto no se puede preparar nada por encima de eso.
- Objetivo máximo (nM)
- 1 ÷ Σ(wᵢ ÷ molaridadᵢ)
- Equimolar
- la media armónica de las molaridades
- Volumen igual
- la media aritmética de las molaridades
Advertencias
- 660 g/mol por bp es la convención en NGS. 650 se usa mucho para el ADN bicatenario en general y las dos se diferencian alrededor de un 1.5%; sigue la norma de tu laboratorio si tiene una. El conversor de ng ↔ pmol de este sitio usa 650 por defecto.
- La longitud es la longitud final de la library, adaptadores incluidos. Introducir solo la longitud del inserto hace que la molaridad salga demasiado alta.
- Esta aritmética da por supuesto que cada library es ADN bicatenario intacto. Los dímeros de adaptador y los fragmentos inflan una lectura fluorométrica, y entonces el número real de clústeres se queda por debajo del cálculo. La cuantificación por qPCR es más robusta frente a eso.
- Como el techo es una media armónica, una sola library muy diluida lo arrastra hacia abajo ella sola. Si el objetivo queda fuera de alcance, mira ahí primero.
- Esta herramienta informa, no arregla. No va a descartar una library ni a bajarte el objetivo: qué library importa es algo que solo sabes tú.
- Los volúmenes se muestran con dos decimales. El cálculo en sí va sin redondear; el redondeo ocurre solo donde se imprime el número.
Preguntas frecuentes
Equimolar si las lecturas deben repartirse por igual. El volumen igual está bien cuando las concentraciones ya son parecidas y quieres menos manipulación. Ponderado cuando alguna library necesita más lecturas que las demás. Diluir y luego agrupar cuando una library está tan concentrada que la equimolar pide una fracción de microlitro.
660 es la convención en NGS, así que es lo que va por defecto aquí. 650 se usa mucho para el ADN bicatenario en general. Las dos se diferencian alrededor de un 1.5%, lo que rara vez cambia una decisión, pero sigue el prospecto de tu kit o la norma de tu laboratorio si alguno da un valor.
Esa library está mucho más concentrada que las demás, así que un volumen minúsculo ya cubre su parte. Dilúyela primero, aumenta el volumen final o usa diluir y luego agrupar. La herramienta no va a elegir por ti.
Ni tomando todo lo que puedes caben los volúmenes dentro del volumen final a esa concentración. La concentración más alta alcanzable para este conjunto aparece al lado; apunta a ella o por debajo, concentra la library más débil o reduce el volumen final.
Porque tiene dos pasos y dos conjuntos de restricciones. Tomar poca solución madre en el paso de dilución y tomar poco —o más de lo que hay— en el paso de pooling se arreglan de forma distinta: lo primero agrandando el volumen diluido, lo segundo ajustando el objetivo o el volumen final.
A ninguna parte. Todo se calcula dentro de tu navegador y nada de lo que escribes se guarda.
Se usan a menudo juntas
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Concentración de ADN/ARN (A260)
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Resuspensión de oligonucleótidos
Pega la lista completa de un pedido y obtén de una vez el volumen de solución amortiguadora de cada tubo, con exportación al portapapeles y a Excel.