Cómo se usa
- Introduce la longitud y la concentración del vector, y cuánto de él entra en la reacción.
- Elige el ensamblaje. Un inserto va a 3 : 1 por defecto; varios fragmentos van equimolares por defecto.
- Pega los insertos, uno por línea. Añade una cuarta celda para dar a una línea su propia razón molar.
- Revisa el volumen de reacción, la concentración del amortiguador y el volumen de ligasa. Por defecto son 20 µL, 10× y 1 µL.
- Pipetea en el orden de la tabla. El agua es el volumen mayor, así que va primero, y la ligasa va la última.
Las fórmulas y lo que hay que vigilar
Ajustar la razón molar es una sola división. El resto es llenar el tubo.
De masa a moles
Un par de bases tiene una masa media, así que una longitud y una masa dan una cantidad. Se usa la misma media que en el conversor de ng ↔ pmol de este sitio.
- pmol
- ng × 1000 / (bp × 650)
- masa de 1 pmol
- bp × 650 / 1000 ng
Cuánto inserto
La cantidad de inserto es la cantidad de vector multiplicada por la razón molar, convertida de vuelta en masa y después en volumen.
- pmol de inserto
- pmol de vector × razón
- ng de inserto
- pmol de inserto × longitud × 650 / 1000
- µL de inserto
- ng de inserto ÷ concentración
Llenar el tubo
El volumen de amortiguador se deduce en vez de consultarse: un amortiguador 10× queda a 1× en una parte de cada diez.
- µL de amortiguador
- volumen de reacción ÷ concentración del amortiguador
- µL de agua
- reacción − ADN − amortiguador − ligasa
Lo que hay que vigilar
- Cuando el agua sale negativa no se muestra nada salvo el tamaño del exceso. Pasa con el ADN diluido, y poner menos vector es el arreglo más fácil.
- 3 : 1 es el punto de partida para la clonación estándar cuando el inserto es más pequeño que el vector (Addgene). Los insertos grandes y los extremos romos suelen obligar a probar en paralelo un abanico de razones.
- Los ensamblajes de varios fragmentos empiezan equimolares. Addgene señala que algunos laboratorios ven una caída brusca del éxito a partir de cinco fragmentos en una misma reacción.
- 650 g/mol por par de bases es una media. Los fragmentos cortos se apartan de ella, y ese error va directo a la razón molar.
- Añade la ligasa al final y no agites en vórtex. Va en glicerol y se queda en una capa; mezcla con suavidad con la pipeta.
- Esto calcula lo que entra, y ahí se para. La temperatura, el tiempo y el manejo de los extremos romos salen del manual de tu enzima.
Preguntas frecuentes
Referencias
De dónde salen la composición de la reacción y los valores por defecto. La aritmética ng ↔ pmol es una definición, y el peso molecular medio por par de bases se importa del conversor ng ↔ pmol.
- Addgene. Protocol — DNA Ligation (How to Ligate Plasmid DNA). Read 2026-08-21.https://www.addgene.org/protocols/dna-ligation/La composición de 10 µL (1 µL de amortiguador 10× o 2 µL de 5×, 0.5–1 µL de ligasa T4, agua hasta 10 µL), la proporción inserto : vector de 3 : 1 para la clonación estándar y unos 100 ng de DNA total
- Addgene. Protocol — Gibson Assembly. Read 2026-08-21.https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/El valor por defecto equimolar para ensamblajes de varios fragmentos («Yields will be best when the DNA fragments are present in equimolar concentrations») y la advertencia de una caída brusca del éxito por encima de cinco fragmentos
Las páginas de protocolos de NEB no se abrían cuando se transcribieron estos valores (una comprobación anti-bots) y no se usaron. No se obtuvo ningún documento específico de Golden Gate, así que el valor equimolar por defecto se apoya solo en el documento de Gibson.
Se usan a menudo juntas
ng ↔ pmol
Convierte entre ng, pmol y número de copias a partir de la longitud del ácido nucleico.
Eficiencia de transformación
Calcula la eficiencia de transformación en cfu/µg a partir del recuento de colonias.
Concentración de ADN/ARN (A260)
Calcula la concentración de ácido nucleico y los cocientes de pureza a partir de la A260.