사용 방법
- 벡터의 길이와 농도, 그리고 반응에 넣을 양(ng)을 적습니다.
- 조립 방식을 고릅니다. 인서트가 하나면 3 : 1, 여러 조각을 한 번에 이으면 등몰이 기본값입니다.
- 인서트를 한 줄에 하나씩 붙여 넣습니다. 줄마다 몰비를 따로 주고 싶으면 네 번째 칸에 적으세요.
- 반응 부피·버퍼 배수·리가아제 부피를 확인합니다. 기본값은 20 µL · 10× · 1 µL 입니다.
- 표에 나온 순서대로 피펫팅합니다. 물이 가장 많으므로 먼저 넣고 리가아제를 마지막에 넣습니다.
공식과 주의사항
몰비를 맞추는 것은 나눗셈 한 번이고, 나머지는 튜브를 채우는 일입니다.
몰수로 바꾸기
염기쌍 하나의 평균 질량이 있으므로 길이와 질량만 알면 몰수가 나옵니다. 이 사이트의 ng ↔ pmol 변환기와 같은 평균값을 씁니다.
- pmol
- ng × 1000 / (bp × 650)
- 1 pmol 의 질량
- bp × 650 / 1000 ng
인서트 양
인서트의 몰수를 벡터 몰수에 몰비를 곱해 정하고, 그것을 다시 질량과 부피로 되돌립니다.
- 인서트 pmol
- 벡터 pmol × 몰비
- 인서트 ng
- 인서트 pmol × 길이 × 650 / 1000
- 인서트 µL
- 인서트 ng ÷ 농도
튜브 채우기
버퍼 부피는 표에서 찾는 것이 아니라 배수에서 나옵니다 — 10× 버퍼는 10분의 1을 넣으면 1×가 됩니다.
- 버퍼 µL
- 반응 부피 ÷ 버퍼 배수
- 물 µL
- 반응 부피 − DNA − 버퍼 − 리가아제
주의사항
- 물이 음수가 되면 계산하지 않고 얼마나 넘치는지 알려 줍니다. DNA 가 묽을 때 생기는 일이고, 넣을 벡터 양(ng)을 줄이는 것이 가장 쉬운 해결입니다.
- 3 : 1 은 「인서트가 벡터보다 작은」 표준 클로닝의 출발점입니다(Addgene). 인서트가 크거나 blunt end 면 비를 바꿔 가며 여러 반응을 걸어 보는 것이 보통입니다.
- 여러 조각을 한 번에 이을 때는 등몰이 기본입니다. Addgene 은 다섯 조각을 넘기면 성공률이 급격히 떨어지는 것을 본 실험실들이 있다고 적어 두었습니다.
- 염기쌍당 650 g/mol 은 평균값입니다. 짧은 조각일수록 실제 조성에서 벗어나고, 이 오차는 몰비에 그대로 들어갑니다.
- 리가아제는 마지막에 넣고 볼텍싱하지 않습니다. 글리세롤이 들어 있어 층이 지므로 피펫으로 부드럽게 섞습니다.
- 이 계산은 「무엇을 넣을지」까지입니다. 온도·시간·평활말단 여부는 쓰시는 효소의 설명서를 따르세요.
자주 묻는 질문
인서트 3 대 벡터 1 입니다. 질량비가 아니라 몰비라서, 인서트가 벡터보다 짧으면 실제로 넣는 ng 은 벡터보다 적습니다. 표의 pmol 칸을 보시면 비가 맞는지 바로 확인됩니다.
DNA 부피가 이미 반응 부피를 넘었다는 뜻입니다. 넣을 벡터 양(ng)을 줄이는 것이 가장 쉽고 대개 충분합니다. 그래도 안 되면 반응 부피를 키우거나 DNA 를 농축하세요.
조립 방식을 「인서트 여러 개」로 바꾸고 목록에 한 줄씩 적으면 됩니다. 기본은 등몰이고, 줄마다 다른 비를 주고 싶으면 네 번째 칸에 적으세요.
버퍼 배수 칸에 5를 넣으면 됩니다. 20 µL 반응이면 4 µL 가 나옵니다 — 표에서 찾는 것이 아니라 배수에서 계산합니다.