Cómo se usa
- Pega la serie de estándares en el primer cuadro: la concentración conocida en la primera columna y la absorbancia en la segunda. Deja el estándar de cero: es el blanco, y el ajuste lo usa como meseta inferior.
- Pega las muestras en el segundo cuadro: nombre, absorbancia y el factor de dilución si la muestra se diluyó antes del pocillo. Separa las columnas con tabulador, coma o dos espacios.
- Lee las concentraciones en la tabla. La dilución ya viene multiplicada, con la concentración del pocillo debajo.
- Comprueba la curva bajo la tabla. Los estándares deberían apoyarse en la línea en los dos extremos; donde no lo hagan, esa meseta es una conjetura y toda concentración cercana la hereda.
- Las filas que dicen que la lectura quedó fuera de la curva no llevan número a propósito. Diluye esas muestras y vuelve a medirlas.
💡 Las unidades son tuyas. Las muestras salen en la unidad en la que entraron los estándares.
Fórmula y notas
Un inmunoensayo no responde en línea recta. Es plano abajo, donde no hay nada que detectar; empinado en el centro; y plano otra vez arriba, donde el anticuerpo se satura. Es una S, y ajustarle una recta falla en todas partes menos en el centro.
La logística de cuatro parámetros es esa S escrita. A es la absorbancia a concentración cero, D la absorbancia donde el ensayo se satura, C la concentración a medio camino entre ambas y B lo empinada que sube la curva al pasar por C.
- Curva estándar
- y = D + (A − D) / (1 + (x / C)^B)
Leer una muestra es la misma ecuación despejada. Es exacta: no hay búsqueda ni aproximación.
- De la absorbancia a la concentración
- x = C × ( (A − y) / (y − D) )^(1/B)
El paréntesis tiene que ser positivo, y de ahí sale toda la seguridad: lo es exactamente cuando la lectura queda estrictamente entre A y D. Una lectura fuera de ellas no tiene concentración — ni grande ni pequeña, ninguna — y la aritmética se niega en lugar de redondear a la meseta más cercana.
La concentración informada es la que tenía la muestra original, así que la dilución se vuelve a multiplicar.
- Con dilución
- concentración = x × factor de dilución
⚠️ La 4PL es simétrica respecto a su inflexión. Los ensayos cuyas mitades superior e inferior tienen formas realmente distintas se ajustan con una logística de cinco parámetros, que esta herramienta no ofrece: un quinto parámetro que nadie sabe cuándo activar hace más daño que una limitación dicha con claridad.
Notas prácticas
- Corre los estándares en la misma placa que las muestras. Una curva traída de ayer trae consigo el tapizado, el sustrato y la incubación de ayer.
- Deja el blanco como estándar de cero en vez de restarlo antes. La meseta inferior es el blanco, estimado a partir de toda la serie en lugar de un solo pocillo; restarlo y luego ajustar una meseta lo cuenta dos veces.
- Los pocillos replicados entran como filas separadas. Un ajuste que conoce los dos pocillos está mejor informado que uno que solo conoce su media, y dos filas que discrepan merecen verse.
- Una absorbancia más allá de una meseta no tiene concentración alguna, ni siquiera una grande. Diluye la muestra y vuelve a medirla; la columna de dilución devuelve la respuesta a la escala original.
- Extrapolado no es lo mismo que imposible. Una concentración por debajo del estándar más bajo o por encima del más alto sí existe sobre la curva, pero allí nunca se midió un calibrador, así que el número es la opinión de la curva.
- Un R² alto dice que la curva pasa cerca de los puntos. No dice nada sobre si se alcanzaron las mesetas, y son las mesetas lo que divide el cálculo inverso.
Preguntas frecuentes
Se usan a menudo juntas
Regresión de curva estándar
Ajusta una regresión lineal para obtener la pendiente, la ordenada en el origen y el R², y después calcula hacia atrás las concentraciones desconocidas.
Diluciones seriadas
Calcula la concentración de cada paso y los volúmenes de solución madre y de diluyente.
Calculadora de IC50 y EC50
Ajusta una sigmoide a datos de dosis–respuesta y devuelve la concentración semimáxima y la pendiente de Hill.