사용 방법
- 첫 칸에 표준물질 계열을 붙여넣습니다 — 앞 열이 이미 아는 농도, 뒤 열이 측정값입니다. 0 농도 표준물질은 빼지 마세요. 그것이 블랭크이고 적합이 그것을 아래 평탄부로 씁니다.
- 둘째 칸에 시료를 붙여넣습니다 — 이름, 측정값, 그리고 웰에 넣기 전에 희석했다면 희석배수. 열은 탭·쉼표·띄어쓰기 두 칸으로 나눕니다.
- 표에서 농도를 읽습니다. 희석배수는 이미 곱해져 있고, 웰 안 농도가 그 아래에 함께 적힙니다.
- 표 아래 곡선으로 확인합니다. 표준물질이 «양쪽 끝»에서 선에 붙어 있어야 합니다. 안 붙어 있으면 그 평탄부는 짐작이고, 그 근처의 농도는 전부 그 짐작을 물려받습니다.
- 「곡선 밖」이라고 적힌 줄은 «일부러» 숫자를 내지 않은 것입니다. 그 시료는 희석해서 다시 읽어 주세요.
💡 단위는 쓰는 사람 것입니다. 표준물질을 넣은 단위 그대로 시료가 나옵니다.
공식과 주의사항
면역측정은 직선으로 답하지 않습니다. 잡을 것이 없는 아래쪽은 평평하고, 가운데는 가파르고, 항체가 포화된 위쪽은 다시 평평합니다 — S 자이고, 여기에 직선을 맞추면 가운데를 빼고는 어디서나 틀립니다.
4-파라미터 로지스틱이 그 S 를 적어 놓은 것입니다. A 는 0 농도에서의 측정값, D 는 포화에서의 측정값, C 는 그 둘의 중간 농도, B 는 C 를 지날 때의 가파른 정도입니다.
- 표준곡선
- y = D + (A − D) / (1 + (x / C)^B)
시료를 읽는 것은 같은 식을 뒤집은 것입니다. 정확한 식이라 탐색도 근사도 없습니다.
- 측정값에서 농도로
- x = C × ( (A − y) / (y − D) )^(1/B)
괄호 안이 «양수»여야 하고, 안전은 전부 여기서 나옵니다. 그것이 양수인 때는 측정값이 A 와 D 사이에 «엄격히» 있을 때뿐입니다. 그 밖의 측정값에는 농도가 없습니다 — 큰 것도 작은 것도 아니라 아예 없습니다. 식은 가까운 평탄부로 반올림하지 않고 거절합니다.
표에 적히는 농도는 원래 시료가 가지고 있던 농도라, 희석배수가 다시 곱해집니다.
- 희석이 있을 때
- 농도 = x × 희석배수
⚠️ 4PL 은 변곡점을 기준으로 «대칭»입니다. 위아래 반쪽의 모양이 정말로 다른 측정법은 5-파라미터 로지스틱으로 맞추는데, 이 도구는 그것을 두지 않았습니다. 언제 켜야 하는지 아무도 모르는 다섯 번째 파라미터는 한계를 분명히 적어 두는 것보다 해롭습니다.
실무 주의사항
- 표준물질은 시료와 «같은 플레이트»에서 돌립니다. 어제 플레이트에서 가져온 곡선은 어제의 코팅·기질·인큐베이션을 함께 가져옵니다.
- 블랭크를 먼저 빼지 말고 0 농도 표준물질로 넣으세요. 아래 평탄부가 곧 블랭크이고, 웰 하나가 아니라 계열 전체에서 추정한 것입니다. 빼고 나서 또 평탄부를 맞추면 같은 것을 두 번 세는 셈입니다.
- 반복 웰은 «각각 한 줄»로 넣습니다. 두 웰을 다 아는 적합이 평균만 아는 적합보다 정보가 많고, 두 줄이 어긋나면 그것 자체가 볼 값어치가 있습니다.
- 평탄부를 넘어간 측정값에는 «농도가 없습니다» — 큰 값이 있는 것이 아닙니다. 희석해서 다시 읽으세요. 희석배수 열이 답을 원래 눈금으로 되돌려 놓습니다.
- 외삽과 불가능은 다릅니다. 가장 낮은 표준물질 아래나 가장 높은 표준물질 위의 농도는 곡선 위에 «존재»하지만 그 자리에서 잰 표준물질이 없으므로, 그 수는 곡선의 의견입니다.
- R² 가 높다는 것은 곡선이 점 근처를 지난다는 뜻입니다. 평탄부에 «도달했는지»는 말해 주지 않는데, 역산이 나누는 것이 바로 평탄부까지의 거리입니다.
자주 묻는 질문
그 측정값이 두 평탄부 중 하나를 넘어갔기 때문입니다. 위쪽을 넘으면 항체가 포화돼 그 위로는 어떤 농도든 같은 값을 내고, 아래쪽을 넘으면 빈 웰보다도 신호가 낮습니다. 두 경우 모두 곡선이 줄 수 있는 농도가 없고, 곡선이 가진 «가장 가까운» 농도를 대신 찍으면 그것은 숫자를 지어내는 일입니다. 희석해서 다시 읽어 주세요.
아니요. 블랭크는 0 농도 표준물질로 넣어 주세요. 적합이 찾아내는 아래 평탄부가 곧 블랭크이고, 웰 하나가 아니라 계열 전체에서 추정한 값입니다. 먼저 빼고 나서 또 평탄부를 맞추면 같은 것을 두 번 세게 됩니다.
최소 다섯 개입니다. 파라미터가 넷이라 그보다 적으면 정할 수 없습니다. 실제로는 두세 자릿수 범위에 걸쳐 일곱에서 여덟 개를 두어야 두 평탄부가 외삽이 아니라 «실측»이 됩니다.
표준물질을 넣은 단위 그대로입니다. 이 도구는 단위를 바꾸지도 짐작하지도 않습니다 — pg/mL 로 넣으면 pg/mL 로 나옵니다.
그쪽은 «직선»을 맞춥니다. 좁은 범위의 단백질 정량처럼 반응이 정말로 비례할 때 맞는 도구입니다. 이 도구는 면역측정이 전 범위에서 그리는 S 자 4-파라미터 로지스틱을 맞춥니다. ELISA 에 직선을 쓰는 것이 바로 사람들이 자기 표준물질 계열의 위아래를 버리게 되는 이유입니다.
꼭 그렇지는 않습니다. R² 는 점이 선에 얼마나 가까운지를 재는데, 역산이 나누는 것은 «평탄부까지의 거리»입니다. 포화에 닿지 못한 계열도 아름답게 맞을 수 있고, 그때 위 평탄부는 데이터가 본 적 없는 자리이며 위쪽의 모든 농도가 그것을 물려받습니다. 그림의 «양쪽 끝»에서 표준물질이 평평해지는지를 보세요.
됩니다. 바꿀 것이 없습니다. 방향은 표준물질에서 적합이 스스로 찾아내고, 두 평탄부는 뜻을 그대로 지킵니다 — 0 농도의 평탄부는 그 값이 높든 낮든 0 농도의 평탄부입니다.