Cómo se usa
- Elige cómo quieres introducir la curva. «Introducir una pendiente» es para cuando ya tienes la pendiente de tu curva estándar; «Ajustar una curva estándar» es para cuando solo tienes concentraciones y valores de Ct, y calcula además la regresión y el gráfico.
- «Introducir una pendiente» necesita un solo número. La pendiente es negativa.
- «Ajustar una curva estándar» toma pares de concentración y Ct en la tabla. Puedes copiar dos columnas de una hoja de cálculo y pegarlas, y se pueden añadir o quitar filas. Introduce las concentraciones tal cual: el logaritmo se toma por ti.
- La eficiencia (%) aparece en grande, con el factor de amplificación por ciclo debajo. En el modo de curva estándar aparecen al lado la pendiente, la ordenada en el origen, el R², el número de puntos y el gráfico.
- El factor de dilución es opcional. No interviene en el cálculo y solo alimenta una nota que te dice cuál debería ser la distancia en Ct entre pasos.
💡 Los exponentes se pueden escribir con e; por ejemplo, 1.5×10⁻⁵ se escribe 1.5e-5.
Fórmula y notas prácticas
Una curva estándar de qPCR es lo que se obtiene al diluir paso a paso una muestra de concentración conocida, medir el Ct de cada paso y ajustar una recta entre el log₁₀(concentración) y el Ct.
- Curva estándar
- Ct = pendiente × log₁₀(concentración) + ordenada en el origen
Una concentración más alta da un Ct más bajo, así que la pendiente es negativa.
De dónde sale la eficiencia
Supón que el producto crece por un factor fijo F en cada ciclo. En el punto en que la fluorescencia alcanza el umbral se cumple esto:
- cantidad inicial × F^Ct = constante
Tomando logaritmos a ambos lados y reordenando se obtiene la relación entre la pendiente y F.
- Pendiente
- pendiente = − 1 ÷ log₁₀(F)
- Factor de amplificación
- F = 10^(−1÷pendiente)
F es el factor de amplificación por ciclo. Una duplicación perfecta significa F = 2, y entonces la pendiente es −1 ÷ log₁₀2 = −3.3219.
La eficiencia es la proporción que se gana en un ciclo, así que es F menos uno.
- Eficiencia
- E(%) = ( 10^(−1÷pendiente) − 1 ) × 100
F = 2 da una eficiencia del 100%. Por eso el máximo teórico es el 100% y no el 200%: el ADN es bicatenario, así que un ciclo como mucho lo duplica.
Qué significa la ordenada en el origen
La ordenada en el origen es el Ct en el que el log₁₀(concentración) vale cero, es decir, el Ct a una concentración de uno. La cuantificación absoluta lee ese número. Por eso esta calculadora no ofrece ninguna opción para forzar la recta por el origen, a diferencia de la calculadora de curva estándar.
El factor de dilución y la pendiente
La pendiente ideal de −3.3219 no depende del factor de dilución. La pendiente responde a «cuántos ciclos se mueve el Ct cuando la concentración cambia diez veces», que es lo mismo diluyas por el factor que diluyas.
Lo que cambia el factor de dilución es la distancia en Ct entre pasos.
- Distancia en Ct por paso
- log₂(factor de dilución)
Una dilución de 10 en 10 da 3.32 ciclos y una de 2 en 2 da 1.00. Es una cifra con la que revisar tus datos a ojo.
Notas prácticas
- Una pendiente positiva significa que los ejes están al revés. El Ct va en el eje y y el log(concentración) en el eje x. Esta calculadora rechaza una pendiente positiva y solo muestra de referencia el valor con el signo cambiado. Retiene la respuesta porque un eje intercambiado es una lectura probable de lo introducido, no una lectura segura.
- El 90–110% es un intervalo de referencia que suele citarse, no un aprobado. Esta calculadora informa del valor; no lo juzga. El intervalo aceptable lo fijan el ensayo y el procedimiento de tu laboratorio.
- Una eficiencia por encima del 100% suele ser inhibición. Nada se ha duplicado de verdad más que eso: los inhibidores de los estándares más concentrados retrasan su Ct más de lo esperado, y eso aplana la pendiente. Prueba a quitar el estándar más concentrado y ajustar de nuevo.
- No incluyas puntos que queden fuera del rango de la curva. Demasiado concentrado trae inhibición; demasiado diluido trae variación estocástica.
- Un R² alto no significa que la eficiencia sea correcta. El R² solo dice cuánto se ajustan los puntos a una recta. Una inhibición que afecte por igual a todos los puntos da una recta preciosa con la pendiente equivocada.
- Las filas con una concentración de cero o menor se dejan fuera del cálculo, porque no se puede tomar el logaritmo. En pantalla se indica cuántas se han descartado.
Preguntas frecuentes
Se usan a menudo juntas
Regresión de curva estándar
Ajusta una regresión lineal para obtener la pendiente, la ordenada en el origen y el R², y después calcula hacia atrás las concentraciones desconocidas.
Cuantificación relativa por qPCR
Calcula los cambios de expresión respecto a un grupo control a partir de valores de Ct de qPCR.
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