Cómo se usa
- Introduce la A280 que has medido, ya con el blanco hecho frente a tu amortiguador.
- Deja el paso óptico en 1 cm salvo que hayas usado una cubeta más corta o un equipo de microvolumen, que de todos modos suele dar el equivalente a 1 cm.
- Di qué clase de coeficiente tienes e introdúcelo. Un coeficiente molar necesita además el peso molecular.
- ¿No tienes coeficiente? Rellena abajo el número de residuos y la página lo calcula a partir de la secuencia.
💡 Los exponentes se pueden escribir con e; por ejemplo, 1.5×10⁻⁵ se escribe 1.5e-5.
Fórmula y notas
Beer-Lambert, A = ε·c·l, despejada para la concentración. Todo lo de esta página es esa única línea; la dificultad está entera en ε, que es una propiedad de tu proteína y no un número que nadie pueda darte.
Tres entradas, un solo cálculo.
- A partir de un coeficiente molar
- c (mol/L) = A ÷ (ε × l) y después mg/mL = c × PM
- A partir de A(1 %, 1 cm)
- c (mg/mL) = A ÷ (A(1 %) ÷ 10 × l)
- A partir de ε0.1 %
- c (mg/mL) = A ÷ (ε0.1 % × l)
Las contribuciones de los residuos
| Residuo | Contribución a ε₂₈₀ | Nota |
|---|---|---|
| Triptófano | 5500 M⁻¹cm⁻¹ | domina el total en la mayoría de las proteínas |
| Tirosina | 1490 M⁻¹cm⁻¹ | |
| Cistina | 125 M⁻¹cm⁻¹ | por puente disulfuro, no por cisteína |
Las tres convenciones de coeficiente describen la misma absorbancia desde concentraciones de referencia distintas: ε es por mol, A(1 %) es la absorbancia de una disolución de 10 mg/mL y ε0.1 % la de una de 1 mg/mL. A(1 %) dividido entre diez es ε0.1 %, y por eso la herramienta pregunta cuál tienes en vez de adivinarlo por el orden de magnitud.
Notas prácticas
- ⭐ Esta herramienta no trae ningún coeficiente de extinción por defecto, y eso es una decisión y no un olvido. «Una A280 de 1 son más o menos 1 mg/mL» se repite en todas partes y no hay ninguna fuente primaria que lo haga cierto para tu proteína. Este sitio no imprime un número sin fuente donde va un criterio; por el mismo motivo se ha negado a trazar una línea de aprobado en el CV del western blot y en la eficiencia de transformación.
- La manera con fuente de obtener ε es a partir de la composición: ε₂₈₀ = 5500·n(Trp) + 1490·n(Tyr) + 125·n(cistina). Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T (1995), How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein, Protein Sci 4(11):2411-2423, ajustada sobre 116 valores medidos en 80 proteínas.
- ⚠️ La limitación que reconoce el propio artículo viaja con él. La predicción es fiable para las proteínas que contienen triptófano y menos fiable para las que no, y está pensada para la proteína plegada en agua. En cloruro de guanidinio 6 M las contribuciones de los residuos son distintas.
- ⚠️ La cistina es la pareja unida por un puente disulfuro, no el número de cisteínas. Contar las cisteínas libres duplica más o menos ese término. Es el único dato de esta página que un lector va a malinterpretar, y por eso la etiqueta lo dice con todas las letras.
- Mantén la lectura dentro del intervalo lineal, más o menos de 0.1 a 1.0 con un paso de 1 cm. Por encima de ahí un espectrofotómetro deja de ser lineal y el número que da ya no es una absorbancia; diluye y vuelve a multiplicar.
- El ácido nucleico también absorbe a 280. Si la A260/A280 está bastante por encima de 0.6 en una proteína pura, la lectura está inflada y esta conversión informará de más concentración de la que hay.
Preguntas frecuentes
Porque no hay ninguno honesto. ε a 280 nm sale del contenido en triptófano, tirosina y cistina, y varía en más de un orden de magnitud entre proteínas reales. Poner de entrada un valor de «proteína típica» sería peor que dejarlo en blanco, porque estaría equivocado en silencio en vez de faltar a la vista: te daría un número y ningún motivo para dudar de él.
De la secuencia. Cuenta los triptófanos, las tirosinas y los puentes disulfuro y usa el recuadro de esta página, que aplica la ecuación ajustada por Pace. Si tu proteína está en una base de datos, ProtParam y la ficha técnica del proveedor publican los dos la misma cifra calculada de la misma manera.
Vale menos, y el artículo original lo dice. La tirosina y la cistina siguen absorbiendo, así que obtienes un número, pero la predicción se ajustó sobre todo con proteínas que contienen triptófano y sin él la dispersión es mayor. Para una proteína sin Trp, un coeficiente medido o un ensayo colorimétrico son el camino más seguro.
Si es un número grande, de miles o de decenas de miles, es la ε molar en M⁻¹cm⁻¹. Si anda entre 5 y 20, es A(1 %), la absorbancia de una disolución de 10 mg/mL. Si anda entre 0.5 y 2, es ε0.1 %, para 1 mg/mL. La herramienta pregunta en vez de deducirlo, porque los rangos se solapan en las proteínas poco corrientes.
Solo con un coeficiente molar, donde es lo que convierte mol/L en mg/mL. Con A(1 %) o con ε0.1 % la concentración másica sale directamente, y el peso molecular es opcional: si lo pones, obtienes también la molaridad.
Probablemente no. La mayoría de los espectrofotómetros salen de su intervalo lineal alrededor de 1.0, y por encima la lectura se queda corta respecto a la absorbancia real. Diluye diez veces, vuelve a leer y multiplica la concentración de vuelta. Una lectura de 0.24 en una dilución de diez veces es un número mejor que 2.4 sin diluir.
Se usan a menudo juntas
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Recetas de geles SDS-PAGE
Introduce porcentaje, número de geles y grosor; obtén las recetas del gel separador y del gel concentrador, además del porcentaje adecuado para el tamaño de tu proteína.
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Cuantificación de Western blot
Convierte las densidades de banda en cambios de expresión, normalizados frente a un control de carga.
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Molaridad ↔ mg/mL
Convierte entre molaridad y concentración másica a través del peso molecular, sin ningún factor de 1000 extraviado.