Cómo se usa
- Introduce la absorbancia A260.
- Elige el tipo de ácido nucleico. Cada uno tiene su propio factor de conversión (dsDNA 50, ssDNA 33, ARN 40, ssOligo 33).
- Si la muestra se diluyó para la lectura, introduce el factor de dilución. Sin diluir es 1.
- Introduce el volumen de muestra y se calculará además la cantidad total (μg). Es opcional.
- Introduce la A280 y la A230 y aparecerán al lado los cocientes de pureza A260/A280 y A260/A230. Es opcional.
💡 Los exponentes se pueden escribir con e; por ejemplo, 1.5×10⁻⁵ se escribe 1.5e-5.
Fórmula y notas
Los ácidos nucleicos absorben con más fuerza alrededor de los 260 nm, por la estructura en anillo de las bases. La absorbancia es proporcional a la concentración, así que multiplicar por un factor de conversión conocido da la concentración.
- Concentración
- concentración (μg/mL) = A260 × factor × dilución
- Cantidad total
- cantidad (μg) = concentración (μg/mL) × volumen (mL)
El factor de conversión es la concentración a la que la A260 marca 1.
| Ácido nucleico | Factor (μg/mL) |
|---|---|
| dsDNA (ADN bicatenario) | 50 |
| ssDNA (ADN monocatenario) | 33 |
| ARN | 40 |
| ssOligo (oligonucleótido monocatenario) | 33 |
Los factores son distintos porque el apilamiento cambia con qué fuerza absorben las bases. En una doble hebra las bases están apiladas unas contra otras, así que la misma cantidad de material absorbe menos.
μg/mL y ng/μL son numéricamente idénticos. 1 μg/mL = 1 ng/μL, así que la cifra no cambia de uno a otro. Los dos están en pantalla para que el valor se pueda copiar en la unidad que usen tus registros.
Cocientes de pureza
| Cociente | Intervalo de referencia | Qué considerar si es bajo |
|---|---|---|
| A260/A280 | ADN alrededor de 1.8, ARN alrededor de 2.0 | Proteína, fenol residual |
| A260/A230 | Alrededor de 2.0 – 2.2 | Sales (guanidina, acetato), disolvente orgánico residual |
Son indicadores de referencia, no criterios de apto o no apto. Que el material sirva en los pasos posteriores depende de la muestra y de para qué sea. Un cociente fuera del intervalo no lo vuelve inservible, y uno dentro no lo vuelve limpio.
Notas prácticas
- Una A260 fuera de 0.1 – 1.0 es difícil de creer, porque cae fuera del intervalo lineal del espectrofotómetro. Diluye y vuelve a leer si es demasiado alta; concentra, o plantéate un método más sensible, si es demasiado baja.
- Haz el blanco con la misma disolución en la que está disuelta la muestra: agua para agua, el mismo TE para TE. Un blanco que no coincide desbarata sobre todo la A230.
- La absorbancia no mide solo el ácido nucleico intacto. Los nucleótidos libres, los fragmentos monocatenarios y los cebadores sobrantes absorben todos a 260 nm. Cuando la cuantificación exacta importa, es mejor un método con colorante fluorescente.
- La absorbancia no distingue el ADN del ARN en una muestra mezclada. Elegir el tipo selecciona el factor del cálculo; no confirma lo que contiene la muestra.
- Una muestra turbia dispersa la luz y da una lectura alta. La precaución habitual es comprobar que la A320 esté cerca de cero.
Preguntas frecuentes
Se usan a menudo juntas
ng ↔ pmol
Convierte masa, cantidad y número de copias de ácidos nucleicos a partir de la longitud y del peso molecular por unidad.
Diluciones
Resuelve C1V1 = C2V2 para el valor que falte.
Pooling de libraries de NGS
Volúmenes que hay que tomar de cada library y amortiguador que hay que añadir, para el pooling equimolar, de volumen igual y ponderado.