Cómo se usa
- Elige el porcentaje del gel separador. Las cuatro opciones de la lista llevan el intervalo de tamaño de proteína para el que las recomienda la fuente; elige “El mío” para escribir cualquier otro porcentaje.
- Introduce cuántos geles vas a verter. No se muestra nada hasta que este campo tiene un número.
- Elige el grosor del espaciador. El volumen que llena un casete Mini-PROTEAN de Bio-Rad va al campo de al lado; para un gel de formato grande, escribe ahí el volumen de tu propio casete.
- Revisa la parte del gel separador y el exceso. El 75% y el 10% por defecto son nuestros, así que ajústalos si tu peine es más hondo o más plano de lo normal.
- Introduce un tamaño de proteína en kDa y la tabla de abajo marcará los porcentajes que lo cubren.
- Prepara las dos recetas en orden. El APS y el TEMED van al final, justo antes de verter.
Fórmula del gel de SDS-PAGE y notas prácticas
Un gel de poliacrilamida cuaja a medida que la acrilamida teje una malla, y el tamaño de los huecos de esa malla es lo que tamiza las proteínas. Más acrilamida significa una malla más cerrada y mejor resolución de las proteínas pequeñas. La composición en sí es un puñado de proporciones, y por eso escala limpiamente a cualquier volumen.
Una capa
Una vez fijado el volumen total, cuatro reactivos salen de él como proporciones. El agua es lo que queda.
- Acrilamida/bis al 30% (mL)
- total × porcentaje ÷ 30
- Amortiguador del gel (mL)
- total × 0.25
- SDS al 10% (mL)
- total × 0.01
- Agua (mL)
- total − acrilamida − amortiguador − SDS
- APS al 10% (µL)
- total en mL × 5
- TEMED (µL)
- separador: total × 0.5 · concentrador: total × 1
Cuánto hay que preparar
El volumen del casete se reparte entre las dos capas, se multiplica por el número de geles y encima se añade el exceso.
- Gel separador (mL)
- casete × parte × geles × (1 + exceso)
- Gel concentrador (mL)
- casete × (1 − parte) × geles × (1 + exceso)
Notas prácticas
- ⚠️ La acrilamida y la bis-acrilamida son neurotóxicas en disolución. El riesgo baja mucho una vez que el gel ha cuajado, pero puede quedar monómero sin polimerizar, así que manipula también con guantes los geles ya vertidos.
- El amortiguador del gel es distinto en cada capa: Tris-HCl 1.5 M a pH 8.8 para el gel separador y Tris-HCl 0.5 M a pH 6.8 para el concentrador. Intercambiarlos impide que las bandas se concentren.
- Prepara el APS fresco cada día y cambia el TEMED cada tres meses: se oxida y va perdiendo actividad catalítica, que es la recomendación de la propia fuente.
- Unas concentraciones de catalizador equivocadas se ven como pocillos mal formados o como telarañas detrás del peine. El remedio de la fuente es subir los catalizadores del gel concentrador a un 0.06% de APS y un 0.12% de TEMED.
- La tabla de volúmenes de casete es la del Mini-PROTEAN de Bio-Rad, y es el volumen que llena un casete por completo. La fuente señala que la cantidad realmente necesaria varía con el peine y con si se está vertiendo también un gel concentrador.
- Los volúmenes de casete de formato grande no están en la tabla: no se ha podido abrir ningún documento primario con ellos. En lugar de publicar una cifra adivinada, el campo se deja editable.
- El 75% para el gel separador y el 10% de exceso son valores nuestros por defecto, no de la fuente. No los cites como cifras con fuente.
Preguntas frecuentes
Se usan a menudo juntas
Geles de agarosa
Convierte un volumen de gel y un porcentaje objetivo en volúmenes de agarosa, solución amortiguadora y colorante, e indica el porcentaje que resuelve el tamaño de fragmento que necesitas.
Cuantificación de Western blot
Convierte las densidades de banda en cambios de expresión, normalizados frente a un control de carga.
Preparación de reactivos
Calcula el volumen de solución madre y de diluyente que hace falta para una concentración y un volumen objetivo.