Cómo se usa
- Copia de la tabla de resultados de tu equipo las columnas de nombre de muestra, nombre de la diana y Cq, y pégalas aquí. Las filas de encabezado se omiten solas.
- Para reunir las réplicas biológicas, pega un nombre de grupo como cuarta columna. Sin él, cada muestra es su propio grupo.
- Elige los genes de referencia. Dos o más se combinan por media geométrica, que en la escala de Ct es la misma aritmética que un promedio normal.
- Elige el grupo control. Todos los cambios en veces se miden con ese grupo puesto a 1.
- Introduce las eficiencias de amplificación si las conoces. Si no, déjalas: el 100 % es la suposición que hace 2^−ΔΔCt.
- La tabla por grupo es la que va a una figura; la tabla por muestra es donde ves cuánto se dispersan las réplicas biológicas.
Las fórmulas y lo que hay que vigilar
Se informan dos métodos, uno al lado del otro. Uno es el conocido y arrastra una suposición; el otro no.
1. Promediar las réplicas técnicas
Los pocillos de la misma muestra y el mismo gen se promedian. La incertidumbre de ese promedio es su error estándar: la desviación estándar dividida entre la raíz cuadrada del número de pocillos.
- Ct medio
- Ct = ΣCtᵢ / n
- Error estándar
- u = s / √n
2. Combinar los genes de referencia
Varios genes de referencia se combinan por la media geométrica de las cantidades. La cantidad va como E^−Ct, así que esa media geométrica es exactamente una media aritmética de los valores de Ct, y por eso los dos métodos de abajo no pueden separarse.
- Ct de referencia
- Ct_ref = ΣCt_i / m
3. Restar dos veces
La referencia se resta a la diana (ΔCt) y después el ΔCt del grupo control se resta a eso (ΔΔCt). La incertidumbre sale de la propagación habitual a través de una diferencia de medias independientes.
- ΔCt
- ΔCt = Ct_diana − Ct_ref
- ΔΔCt
- ΔΔCt = ΔCt_muestra − ΔCt_control
- Cambio en veces
- 2^−ΔΔCt
- Propagación
- u(A − B) = √(u(A)² + u(B)²)
4. Corregir por la eficiencia (Pfaffl)
La ecuación de Pfaffl no supone una eficiencia de 2. Deja todas las eficiencias al 100 % y se convierte en la ecuación de arriba.
- Razón
- R = E_diana^ΔCP_diana / E_ref^ΔCP_ref
- ΔCP
- Ct del control − Ct de la muestra
- De la eficiencia a la base
- E = 1 + eficiencia(%) / 100
Lo que hay que vigilar
- 2^−ΔΔCt supone que la diana y la referencia amplifican las dos exactamente a 2. Pfaffl expone esa suposición en su artículo y dice que el método solo sirve para una estimación rápida. Enseñar las dos columnas es como se hace visible el tamaño de la suposición.
- Tres genes de referencia son el punto de partida recomendado (Vandesompele et al., 2002). Con uno, una referencia que responda al tratamiento inclina el resultado entero y nada en la página puede avisarte de que ha pasado.
- Las réplicas técnicas y las biológicas miden cosas distintas. Tres pocillos de una misma placa te hablan del pipeteo; tres placas te hablan de biología. Esta herramienta las mantiene separadas hasta el final y escribe en la tabla de qué nivel salió cada barra de error.
- El error es un error estándar propagado, no un intervalo de confianza, y no es una prueba de significación.
- El cambio en veces del grupo control es 1 por construcción y no por medida, así que sobre él no se dibuja ninguna barra. En su lugar se muestra aparte la dispersión de su propio ΔCt.
- Un pocillo que nunca amplificó no es un cero. Introducirlo como cero hace que esa muestra parezca la que más expresa de toda la serie, así que esas líneas se dejan fuera de las medias y se cuentan por ti.
Preguntas frecuentes
Se usan a menudo juntas
Eficiencia de amplificación en qPCR
Calcula la eficiencia de amplificación (%) y el factor por ciclo a partir de la pendiente de una curva estándar.
Creador de gráficos con barras de error
Dibuja un gráfico de barras de error a partir de datos agrupados, con los estadísticos de resumen.
Selector de prueba estadística
Elige la prueba estadística que encaja con tus datos y la ejecuta.