사용 방법
- 입력 방식을 선택합니다. 「기울기 직접 입력」은 표준곡선의 기울기를 이미 알고 있을 때, 「표준곡선에서 구하기」는 농도와 Ct 값만 있을 때 사용합니다. 후자는 회귀와 그래프까지 함께 계산됩니다.
- 「기울기 직접 입력」은 값 하나만 입력하면 됩니다. 기울기는 음수입니다.
- 「표준곡선에서 구하기」는 표에 농도와 Ct 쌍을 입력합니다. 엑셀에서 두 열을 복사해 붙여넣기도 가능하며, 행은 추가·삭제할 수 있습니다. 농도는 원래 값 그대로 입력하세요. 로그 변환은 내부에서 처리합니다.
- 결과에 효율(%)이 크게 표시되고, 그 아래에 사이클당 증폭 배수가 표시됩니다. 표준곡선 모드에서는 기울기·절편·R²·점 개수와 그래프가 함께 표시됩니다.
- 희석배수는 선택 입력입니다. 계산에는 반영되지 않고, 단계별 Ct 간격을 안내하는 데만 사용됩니다.
💡 지수는 e를 사용해 입력할 수 있습니다. 예를 들어 1.5×10⁻⁵ 은 1.5e-5 로 입력하면 계산됩니다.
공식 설명 및 주의사항
qPCR에서 표준곡선은 알고 있는 농도의 시료를 단계별로 희석해 각각의 Ct를 측정하고, log₁₀(농도)와 Ct 사이의 직선을 구한 것입니다.
- 표준곡선
- Ct = 기울기 × log₁₀(농도) + 절편
농도가 높을수록 Ct가 낮으므로 기울기는 음수입니다.
기울기에서 효율이 나오는 이유
한 사이클마다 산물이 일정 배수 F로 증가한다고 하면, 형광이 임계치에 도달하는 시점에서 다음이 성립합니다.
- 시작량 × F^Ct = 일정
양변에 로그를 취해 정리하면 기울기와 F의 관계가 도출됩니다.
- 기울기
- 기울기 = − 1 ÷ log₁₀(F)
- 증폭 배수
- F = 10^(−1÷기울기)
F가 사이클당 증폭 배수입니다. 완전히 두 배가 되면 F = 2이고, 이때 기울기는 −1 ÷ log₁₀2 = −3.3219입니다.
효율은 한 사이클에 증가한 비율이므로 F에서 1을 뺀 값입니다.
- 효율
- 효율(%) = ( 10^(−1÷기울기) − 1 ) × 100
F = 2이면 효율 100 %입니다. 이론상 최대가 200 %가 아니라 100 %인 이유가 여기 있습니다. DNA는 두 가닥이므로 한 사이클에 최대 2배까지만 증가합니다.
절편의 의미
절편은 log₁₀(농도)가 0일 때, 즉 농도가 1일 때의 Ct입니다. 절대 정량에서는 이 값을 읽습니다. 그래서 이 계산기는 절편을 0으로 고정하는 기능을 제공하지 않습니다. 표준곡선 계산기와 다른 점입니다.
희석배수와 기울기
이상적인 기울기 −3.3219는 희석배수와 무관합니다. 기울기는 「농도가 10배 변할 때 Ct가 몇 사이클 이동하는가」이므로 어떤 배수로 희석했든 동일합니다.
희석배수가 바꾸는 것은 단계 사이의 Ct 간격입니다.
- 단계당 Ct 간격
- log₂(희석배수)
10배 희석이면 3.32 사이클, 2배 희석이면 1.00 사이클입니다. 이 값은 데이터가 정상인지 육안으로 확인할 때 사용합니다.
실무 주의사항
- 기울기가 양수로 나오면 축이 뒤바뀐 것입니다. Ct를 y축, log(농도)를 x축에 두어야 합니다. 이 계산기는 양수 기울기를 받으면 계산을 거부하고 부호를 뒤집은 값만 참고로 표시합니다. 답을 제시하지 않는 이유는 축이 바뀌었다는 해석이 확실하지 않기 때문입니다.
- 90~110 %는 통용되는 참고 범위이지 합격 기준이 아닙니다. 이 계산기는 값을 계산할 뿐 판정하지 않습니다. 허용 범위는 검사 항목과 실험실 절차서가 정합니다.
- 효율이 100 %를 초과하는 것은 대개 저해 물질 때문입니다. 실제로 2배 이상 증폭된 것이 아니라, 고농도 시료에서 저해가 발생해 Ct가 예상보다 늦게 나오면서 기울기가 완만해진 결과입니다. 가장 진한 표준을 제외하고 재계산해 보세요.
- 표준곡선 범위를 벗어난 점은 입력하지 마세요. 농도가 너무 높으면 저해가, 너무 낮으면 확률적 변동이 커집니다.
- R²가 높다고 효율이 정확하다는 뜻은 아닙니다. R²는 점들이 직선을 얼마나 잘 따르는지만 나타냅니다. 저해가 모든 점에 균일하게 작용하면 직선은 잘 맞으면서 기울기만 왜곡됩니다.
- 농도가 0 이하인 행은 계산에서 제외됩니다. 로그를 취할 수 없기 때문이며, 제외된 개수가 화면에 표시됩니다.
자주 묻는 질문
참고문헌
효율 식의 출처입니다. 기울기를 구하는 직선 회귀는 표준곡선 계산기와 같은 최소제곱이라 인용하지 않습니다.
- Pfaffl MW. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29(9):e45.doi:10.1093/nar/29.9.e45E = 10^(−1/기울기) — 한 주기당 증폭 배수. 이 도구의 「효율 %」는 (E − 1) × 100 으로, 2 가 100 % 입니다
- Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. (2009) The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 55(4):611–622.doi:10.1373/clinchem.2008.112797같은 식을 효율 = 10^(−1/기울기) − 1 로 적고 「이론 최대 1.00(100 %)은 주기마다 산물이 두 배」라고 정의합니다. 효율은 표준곡선의 기울기에서 구해 보고하라는 지침의 출처
이 페이지가 참고 범위로 표시하는 90–110 %는 여러 프로토콜이 통용하는 관례이며, 위 두 문서는 범위를 규정하지 않습니다. 1차 출처를 확인하지 못해 출처 없이 둡니다.