Cómo se usa
- ① Elige el modo de cultivo. El adherente toma el objetivo en células/cm² y el de suspensión en células/mL. En las placas, elige además cómo se llenan los pocillos.
- ② Introduce la densidad celular actual y la viabilidad. La densidad es la que te da la calculadora de recuento celular. No se muestra nada hasta que este campo tiene un número.
- ③ Revisa la densidad de siembra objetivo y añade filas de recipientes. Al elegir un recipiente viene con él el volumen de medio que recomienda la fuente, y en las placas se pueden dejar vacíos los pocillos de borde.
- ④ Lee la receta de trabajo: la suspensión y el medio de cada recipiente, más los totales. Si el volumen por pocillo sale demasiado pequeño, se propone una dilución junto a él.
- ⑤ Mira qué viene después.
Fórmula de la siembra celular y notas prácticas
Sembrar es una sola división: las células que necesitas entre la densidad que tienes. El trabajo está a ambos lados: contar solo las células vivas, preparar una placa como una mezcla única en vez de pocillo a pocillo, dejar los bordes fuera y saber qué hacer cuando la respuesta es un volumen que nadie puede pipetear.
La fórmula
El cultivo adherente y el de suspensión solo se diferencian en la línea que calcula cuántas células hacen falta.
- Densidad de células vivas (células/mL)
- densidad actual × viabilidad ÷ 100
- Células necesarias — adherentes
- objetivo (células/cm²) × área de crecimiento (cm²)
- Células necesarias — en suspensión
- objetivo (células/mL) × volumen de trabajo (mL)
- Suspensión (mL)
- células necesarias ÷ densidad de células vivas
- Medio (mL)
- volumen de trabajo − suspensión
- Dilución
- densidad de células vivas ÷ densidad en el pocillo
Dejar los bordes fuera
Saltarse el anillo exterior deja (filas − 2) × (columnas − 2) pocillos.
- 96 pocillos (8 × 12)
- 6 × 10 = 60 pocillos — 36 quedan vacíos
- 48 pocillos (6 × 8)
- 4 × 6 = 24 pocillos
- 24 pocillos (4 × 6)
- 2 × 4 = 8 pocillos
- 12 pocillos (3 × 4)
- 1 × 2 = 2 pocillos
- 6 pocillos (2 × 3)
- 0 pocillos — todos son pocillos de borde
Notas prácticas
- ⚠️ Las cifras de confluencia de la tabla de recipientes se midieron con células HeLa: la fuente lo dice en una nota al pie. Varían muchísimo entre líneas celulares, así que no las traslades sin más.
- ⚠️ El 10% de exceso y el mínimo de 2 µL para pipetear son valores nuestros por defecto y no están tomados de ninguna fuente. No los cites como cifras con fuente.
- Preparar una mezcla única no es una comodidad: es una respuesta distinta. Llenar los pocillos de uno en uno hace que el error de cada trasvase de unos pocos microlitros caiga directamente sobre el número de células de ese pocillo.
- Los pocillos de borde se evaporan más rápido, así que se suelen dejar vacíos o llenar con PBS. En una placa de 96 pocillos eso deja 60 pocillos utilizables.
- No hay valores predefinidos por línea celular. No se ha podido conseguir ninguna fuente primaria de densidades de siembra ni tiempos de duplicación por línea —las propias fichas de producto de la ATCC no publican el tiempo de duplicación— y varían tanto con las condiciones que un valor por defecto adivinado sería peor que ninguno.
- Tampoco aparecen los matraces de agitación ni los biorreactores: no se ha podido abrir ningún documento primario con sus volúmenes de trabajo recomendados. El trabajo en suspensión no se bloquea por esto, ya que el volumen de trabajo se escribe directamente.
- Después de sembrar células adherentes, desliza la placa adelante y atrás en vez de moverla en círculos, o las células se juntarán en el centro.
Preguntas frecuentes
Al elegir un recipiente se rellena con lo que recomienda la tabla de referencia. Eso es una cifra general: depende de la línea celular y de lo que estés haciendo. El factor que más pesa es cuándo las necesitas: siembra denso para mañana y ralo para dentro de tres días.
La respuesta misma. Llenar los pocillos de uno en uno suele significar unos pocos microlitros de suspensión por pocillo, y el error de cada uno de esos trasvases pequeños cae directamente sobre el número de células de ese pocillo. Preparar una mezcla única a la densidad objetivo y repartir volúmenes iguales lo elimina. En las placas, tómalo como la opción por defecto.
El anillo exterior pierde medio por evaporación más rápido que los pocillos interiores, así que las condiciones se van separando a lo largo de la placa. Dejarlo vacío, o llenarlo con PBS o agua estéril, es una práctica habitual. En una placa de 96 pocillos eso quita 36 pocillos y deja 60, y el cálculo sigue a esos 60.
Entonces no se limita a avisar, sino que propone: cuánto hay que diluir la suspensión y cuántos microlitros tomar de ahí por pocillo. El factor elegido es el más pequeño que supera el mínimo, porque cada paso de trasvase de más es otro paso en el que equivocarse. Sube el mínimo de pipeteo si quieres más margen.
No se ha podido conseguir ninguna fuente primaria de densidades de siembra ni tiempos de duplicación por línea. Las fichas de producto de la ATCC no publican tiempos de duplicación, y las cifras de las guías de sistemas de expresión son densidades del día de la transfección, que estarían mal como valores por defecto de un pase rutinario. Dado cuánto varían con las condiciones, dejarlas fuera es mejor que servir una suposición como valor por defecto.
Las células muertas se cuentan pero no crecen, así que la densidad se recalcula a partir de las vivas. Con un 80% de viabilidad hace falta un 25% más de suspensión para llevar el mismo número de células, y la página lo dice en una frase.
Se usan a menudo juntas
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Recuento celular
Convierte los recuentos de la cámara de Neubauer en células/mL, células totales y viabilidad.
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Analizador de curvas de crecimiento
Obtiene la tasa de crecimiento y el tiempo de duplicación a partir de una serie temporal.
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Diluciones
Resuelve C1V1 = C2V2 para el valor que falte.