사용 방법
- 완충액으로 블랭크를 잡고 측정한 A280 값을 입력합니다.
- 광로 길이는 1 cm 그대로 두세요. 더 짧은 셀을 썼거나 마이크로볼륨 장비를 쓴 경우에만 바꾸는데, 그런 장비도 보통 1 cm 환산값을 내줍니다.
- 가지고 있는 계수의 종류를 고르고 값을 입력합니다. 몰 흡광계수라면 분자량도 함께 필요합니다.
- 계수가 없다면 아래 잔기 수 칸을 채우세요. 서열에서 계산해 줍니다.
💡 지수는 e를 사용해 입력할 수 있습니다. 예를 들어 1.5×10⁻⁵ 은 1.5e-5 로 입력하면 계산됩니다.
공식 설명 및 주의사항
Beer-Lambert 식 A = ε·c·l 을 농도에 대해 푼 것입니다. 이 페이지의 전부가 그 한 줄이고, 어려움은 전적으로 ε 에 있습니다. ε 은 «당신 단백질의 성질»이지 누가 대신 알려 줄 수 있는 수가 아닙니다.
들어오는 길은 셋, 계산은 하나입니다.
- 몰 흡광계수에서
- c (mol/L) = A ÷ (ε × l) 그리고 mg/mL = c × MW
- A(1 %, 1 cm) 에서
- c (mg/mL) = A ÷ (A(1 %) ÷ 10 × l)
- ε0.1 % 에서
- c (mg/mL) = A ÷ (ε0.1 % × l)
잔기별 기여
| 잔기 | ε₂₈₀ 기여 | 비고 |
|---|---|---|
| 트립토판 | 5500 M⁻¹cm⁻¹ | 대부분의 단백질에서 총합을 좌우합니다 |
| 티로신 | 1490 M⁻¹cm⁻¹ | |
| 시스틴 | 125 M⁻¹cm⁻¹ | 이황화 결합 하나당이지 시스테인 하나당이 아닙니다 |
세 가지 계수 관행은 같은 흡광도를 서로 다른 기준 농도에서 적은 것입니다. ε 은 몰당, A(1 %) 는 10 mg/mL 용액의 흡광도, ε0.1 % 는 1 mg/mL 용액의 흡광도입니다. A(1 %) 를 10으로 나누면 ε0.1 % 가 됩니다. 그래서 이 도구는 값의 크기로 짐작하지 않고 어느 쪽인지 묻습니다.
실무 주의사항
- ⭐ 이 도구는 기본 흡광계수를 싣지 않고, 그것은 빠뜨린 것이 아니라 «정한 것»입니다. 「A280이 1이면 대략 1 mg/mL」은 어디서나 반복되지만, 당신 단백질에 대해 그것을 참으로 만들어 주는 1차 출처는 없습니다. 이 사이트는 판정 자리에 출처 없는 수를 놓지 않습니다. 웨스턴 블롯 CV 문턱값과 형질전환 효율 합격선에서도 같은 이유로 거절했습니다.
- 출처가 있는 방법은 조성에서 구하는 것입니다. ε₂₈₀ = 5500·n(Trp) + 1490·n(Tyr) + 125·n(시스틴). Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T (1995), How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein, Protein Sci 4(11):2411-2423 — 단백질 80종의 측정값 116건에 맞춘 식입니다.
- ⚠️ 원논문의 한계도 함께 따라옵니다. 트립토판을 포함한 단백질에서 신뢰할 만하고, 없는 단백질에서는 덜 신뢰할 만합니다. 접힌 상태·물 용매 기준입니다. 6 M 구아니디늄 염산염 안에서는 잔기별 기여가 다릅니다.
- ⚠️ 시스틴은 이황화 «쌍»이지 시스테인 개수가 아닙니다. 유리 시스테인을 세면 그 항이 대략 두 배가 됩니다. 이 페이지에서 사람들이 잘못 읽는 유일한 입력이라 라벨에 풀어 적었습니다.
- 측정값을 선형 구간에 두세요. 1 cm 광로에서 대략 0.1~1.0 입니다. 그 위로는 분광광도계가 선형이 아니라서 나오는 수가 더 이상 흡광도가 아닙니다. 희석해서 재고 배수를 곱해 되돌리세요.
- 핵산도 280 nm 에서 흡수합니다. 순수한 단백질인데 A260/A280 이 0.6 을 한참 넘으면 측정값이 부풀려진 것이고, 이 환산은 농도를 과대평가합니다.
자주 묻는 질문
정직한 기본값이 없기 때문입니다. 280 nm 의 ε 은 트립토판·티로신·시스틴 함량에서 나오고, 실제 단백질 사이에서 10배 넘게 차이 납니다. 「대표적인 단백질」 값을 심어 두면 비워 두는 것보다 «나쁩니다». 눈에 띄게 없는 대신 조용히 틀리기 때문입니다. 수는 나오는데 의심할 이유가 없어집니다.
서열에서 구합니다. 트립토판·티로신·이황화 결합 수를 세어 이 페이지의 칸에 넣으면 Pace 식으로 계산합니다. 데이터베이스에 있는 단백질이라면 ProtParam 과 공급사 자료가 같은 방식으로 계산한 같은 값을 싣고 있습니다.
덜 맞고, 원논문이 그렇게 적고 있습니다. 티로신과 시스틴도 흡수하므로 값은 나오지만, 그 식은 주로 트립토판을 가진 단백질에 맞춰졌고 없으면 흩어짐이 큽니다. Trp 가 없는 단백질이라면 실측 계수나 발색 정량법이 안전한 길입니다.
수천~수만 단위의 큰 수라면 M⁻¹cm⁻¹ 단위의 몰 ε 입니다. 5~20 근처라면 A(1 %) 로, 10 mg/mL 용액의 흡광도입니다. 0.5~2 근처라면 1 mg/mL 기준의 ε0.1 % 입니다. 특이한 단백질에서는 범위가 겹치기 때문에 이 도구는 추측하지 않고 묻습니다.
몰 흡광계수일 때만 필요합니다. mol/L 을 mg/mL 로 바꾸는 것이 분자량이니까요. A(1 %) 나 ε0.1 % 를 쓰면 질량농도가 바로 나오고 분자량은 선택입니다. 넣으면 몰농도도 함께 나옵니다.
아마 아닙니다. 대부분의 분광광도계는 1.0 부근에서 선형 구간을 벗어나고, 그 위에서는 흡광도를 실제보다 낮게 읽습니다. 10배 희석해 다시 재고 농도에 10을 곱하세요. 10배 희석에서 읽은 0.24 가 희석하지 않은 2.4 보다 나은 값입니다.