사용 방법
- 완충액으로 블랭크를 잡고 측정한 A280 값을 입력합니다.
- 광로 길이는 1 cm 그대로 두세요. 더 짧은 셀을 사용했거나 마이크로볼륨 장비를 사용한 경우에만 변경하는데, 그런 장비도 통상 1 cm 환산값을 출력합니다.
- 보유한 계수의 종류를 선택하고 값을 입력합니다. 몰 흡광계수라면 분자량도 함께 필요합니다.
- 계수가 없다면 아래 잔기 수 칸을 입력하세요. 서열로부터 계산해 줍니다.
💡 지수는 e를 사용해 입력할 수 있습니다. 예를 들어 1.5×10⁻⁵ 은 1.5e-5 로 입력하면 계산됩니다.
공식 설명 및 주의사항
Beer-Lambert 식 A = ε·c·l을 농도에 대해 푼 것입니다. 이 페이지의 전부가 그 한 줄이며, 어려움은 전적으로 ε에 있습니다. ε은 해당 단백질 고유의 성질이지 일반적으로 제공할 수 있는 값이 아닙니다.
입력 방식은 셋, 계산식은 하나입니다.
- 몰 흡광계수에서
- c (mol/L) = A ÷ (ε × l) 그리고 mg/mL = c × MW
- A(1 %, 1 cm) 에서
- c (mg/mL) = A ÷ (A(1 %) ÷ 10 × l)
- ε0.1 % 에서
- c (mg/mL) = A ÷ (ε0.1 % × l)
잔기별 기여
| 잔기 | ε₂₈₀ 기여 | 비고 |
|---|---|---|
| 트립토판 | 5500 M⁻¹cm⁻¹ | 대부분의 단백질에서 총합을 좌우합니다 |
| 티로신 | 1490 M⁻¹cm⁻¹ | |
| 시스틴 | 125 M⁻¹cm⁻¹ | 이황화 결합 하나당이지 시스테인 하나당이 아닙니다 |
세 가지 계수 관행은 같은 흡광도를 서로 다른 기준 농도로 표기한 것입니다. ε은 몰당, A(1 %)는 10 mg/mL 용액의 흡광도, ε0.1 %는 1 mg/mL 용액의 흡광도입니다. A(1 %)를 10으로 나누면 ε0.1 %가 됩니다. 그래서 이 도구는 값의 크기로 추정하지 않고 어느 쪽인지 직접 묻습니다.
실무 주의사항
- ⭐ 이 도구는 기본 흡광계수를 제공하지 않으며, 이는 누락이 아니라 의도적인 결정입니다. 「A280이 1이면 대략 1 mg/mL」은 널리 통용되지만, 특정 단백질에 대해 그것을 참으로 만들어 주는 1차 출처는 없습니다. 이 사이트는 판정 근거가 되는 자리에 출처 없는 수치를 두지 않습니다. 웨스턴블롯 CV 기준값과 형질전환 효율 합격선에서도 같은 이유로 제공하지 않았습니다.
- 출처가 있는 방법은 조성에서 산출하는 것입니다. ε₂₈₀ = 5500·n(Trp) + 1490·n(Tyr) + 125·n(시스틴). Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T (1995), How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein, Protein Sci 4(11):2411-2423 — 단백질 80종의 측정값 116건에 적합한 식입니다.
- ⚠️ 원논문의 한계도 함께 적용됩니다. 트립토판을 포함한 단백질에서는 신뢰도가 높고, 없는 단백질에서는 낮습니다. 접힌 상태·수용매 기준이며, 6 M 구아니디늄 염산염 조건에서는 잔기별 기여가 달라집니다.
- ⚠️ 시스틴은 이황화 결합 쌍의 수이지 시스테인 개수가 아닙니다. 유리 시스테인을 세면 그 항이 약 2배가 됩니다. 이 페이지에서 가장 자주 오해되는 입력이라 라벨에 풀어 적었습니다.
- 측정값을 선형 구간에 두세요. 1 cm 광로에서 대략 0.1~1.0입니다. 그 이상에서는 분광광도계가 선형성을 벗어나 출력값이 더 이상 흡광도가 아닙니다. 희석해 재측정한 뒤 배수를 곱해 환원하세요.
- 핵산도 280 nm에서 흡수합니다. 순수한 단백질인데 A260/A280이 0.6을 크게 초과하면 측정값이 과대평가된 것이며, 이 환산도 농도를 과대평가합니다.
자주 묻는 질문
타당한 기본값이 존재하지 않기 때문입니다. 280 nm의 ε은 트립토판·티로신·시스틴 함량에서 결정되며, 실제 단백질 사이에서 10배 이상 차이 납니다. 「대표적인 단백질」 값을 넣어 두면 비워 두는 것보다 나쁩니다. 값이 없는 것은 눈에 띄지만, 잘못된 값은 조용히 틀리기 때문입니다. 수치는 나오는데 의심할 근거가 사라집니다.
서열에서 산출합니다. 트립토판·티로신·이황화 결합 수를 세어 이 페이지의 칸에 입력하면 Pace 식으로 계산합니다. 데이터베이스에 등록된 단백질이라면 ProtParam과 공급사 자료가 같은 방식으로 계산한 동일한 값을 제공합니다.
정확도가 낮으며, 원논문도 그렇게 기술하고 있습니다. 티로신과 시스틴도 흡수하므로 값은 산출되지만, 그 식은 주로 트립토판을 포함한 단백질에 적합하고 없으면 산포가 큽니다. Trp가 없는 단백질이라면 실측 계수나 발색 정량법이 안전합니다.
수천~수만 단위의 큰 값이라면 M⁻¹cm⁻¹ 단위의 몰 ε입니다. 5~20 부근이라면 A(1 %)로, 10 mg/mL 용액의 흡광도입니다. 0.5~2 부근이라면 1 mg/mL 기준의 ε0.1 %입니다. 특이한 단백질에서는 범위가 겹치므로 이 도구는 추정하지 않고 직접 묻습니다.
몰 흡광계수를 사용할 때만 필요합니다. mol/L을 mg/mL로 환산하는 것이 분자량이기 때문입니다. A(1 %)나 ε0.1 %를 사용하면 질량농도가 바로 산출되며 분자량은 선택 사항입니다. 입력하면 몰농도도 함께 표시됩니다.
대개 신뢰하기 어렵습니다. 대부분의 분광광도계는 1.0 부근에서 선형 구간을 벗어나며, 그 이상에서는 흡광도를 실제보다 낮게 측정합니다. 10배 희석해 재측정하고 농도에 10을 곱하세요. 10배 희석에서 측정한 0.24가 희석하지 않은 2.4보다 신뢰도가 높습니다.
참고문헌
흡광계수 예측식의 출처입니다. A = ε·c·l(비어–람베르트 법칙) 자체는 정의라 인용하지 않습니다.
- Pace CN, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T. (1995) How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci 4(11):2411–2423.doi:10.1002/pro.5560041120ε₂₈₀ = 5500·Trp + 1490·Tyr + 125·시스틴 — 세 계수 전부. 단백질 80종의 측정값 116건에 맞춘 값이며 트립토판이 없는 단백질에서는 덜 정확하다는 단서도 이 논문의 것입니다