사용 방법
- A260 흡광도를 입력합니다.
- 핵산 종류를 고릅니다. 종류마다 환산계수가 다릅니다 (dsDNA 50, ssDNA 33, RNA 40, ssOligo 33).
- 분광광도계에서 시료를 희석해 측정했다면 희석배수를 입력합니다. 희석하지 않았으면 1입니다.
- 시료 부피를 넣으면 총량(μg)까지 계산됩니다. (선택)
- A280, A230을 넣으면 순도 지표 A260/A280, A260/A230이 함께 표시됩니다. (선택)
지수는 e를 사용해 입력할 수 있습니다. 예를 들어 1.5×10⁻⁵ 은 1.5e-5 로 입력하면 계산됩니다.
공식 설명 및 주의사항
핵산은 260 nm 부근에서 빛을 가장 잘 흡수합니다. 염기의 고리 구조가 그 파장을 흡수하기 때문입니다. 흡광도가 농도에 비례하므로, 미리 알려진 환산계수를 곱하면 농도가 나옵니다.
- 농도
- 농도(μg/mL) = A260 × 환산계수 × 희석배수
- 총량
- 총량(μg) = 농도(μg/mL) × 부피(mL)
환산계수는 A260 = 1 일 때의 농도를 뜻합니다.
| 핵산 종류 | 환산계수 (μg/mL) |
|---|---|
| dsDNA (이중가닥 DNA) | 50 |
| ssDNA (단일가닥 DNA) | 33 |
| RNA | 40 |
| ssOligo (단일가닥 올리고) | 33 |
종류마다 값이 다른 이유는 염기가 쌓인 구조에 따라 흡광이 달라지기 때문입니다. 이중가닥은 염기가 서로 겹쳐 쌓여 있어 같은 양이라도 흡광이 낮게 나옵니다.
μg/mL과 ng/μL은 수치가 같습니다. 1 μg/mL = 1 ng/μL 이므로, 두 단위로 표시해도 숫자는 바뀌지 않습니다. 화면에 둘 다 보여 주는 것은 어느 단위로 기록하든 그대로 옮겨 적을 수 있게 하기 위해서입니다.
순도 지표
| 비율 | 참고 범위 | 낮을 때 의심해 볼 것 |
|---|---|---|
| A260/A280 | DNA 약 1.8, RNA 약 2.0 | 단백질, 페놀 잔류 |
| A260/A230 | 약 2.0 ~ 2.2 | 염류(구아니딘, 아세트산염), 유기용매 잔류 |
이 값들은 참고 지표이며 합격·불합격 판정 기준이 아닙니다. 실제로 후속 실험이 되는지는 시료와 용도에 따라 다릅니다. 범위를 벗어났다고 반드시 못 쓰는 것도, 범위 안이라고 반드시 깨끗한 것도 아닙니다.
실무 주의사항
- A260이 0.1 ~ 1.0 범위를 벗어나면 값을 믿기 어렵습니다. 분광광도계의 선형 범위를 벗어나기 때문입니다. 너무 높으면 희석해서 다시 측정하고, 너무 낮으면 농축하거나 더 정밀한 방법을 고려하세요.
- 블랭크는 시료를 녹인 것과 같은 용액으로 잡습니다. 물에 녹였으면 물로, TE 버퍼에 녹였으면 같은 TE로요. 다르면 A230이 특히 크게 어긋납니다.
- 흡광법은 순수한 핵산만 재지 않습니다. 유리 뉴클레오타이드, 단일가닥 조각, 남은 프라이머도 260 nm를 흡수합니다. 정확한 정량이 필요하면 형광 염료 기반 방법이 낫습니다.
- RNA에 DNA가 섞여 있어도 흡광법은 구별하지 못합니다. 종류 선택은 어디까지나 계산에 쓸 계수를 고르는 것이지 시료가 실제로 그 종류임을 확인하는 것이 아닙니다.
- 시료가 탁하면 산란 때문에 흡광도가 높게 나옵니다. A320이 0에 가까운지 확인하는 것이 관행입니다.