사용 방법
- 장비가 출력한 결과 표에서 시료 이름·타깃 이름·Cq 세 열을 복사해 붙여넣습니다. 머리글 행은 자동으로 제외됩니다.
- 생물반복을 묶으려면 네 번째 칸에 그룹 이름을 함께 붙여넣습니다. 없으면 시료 하나가 곧 하나의 그룹입니다.
- 참조유전자를 선택합니다. 두 개 이상 선택하면 기하평균으로 묶이며, Ct 축에서는 그것이 산술평균과 동일한 계산입니다.
- 대조군을 선택합니다. 모든 배수가 이 그룹을 1로 두고 계산됩니다.
- 증폭 효율을 아신다면 유전자마다 입력합니다. 모르면 그대로 두세요. 100 %가 2^−ΔΔCt의 가정입니다.
- 그룹별 표가 논문 그림에 사용할 값이며, 시료별 표는 생물반복의 산포를 확인하는 곳입니다.
공식과 주의사항
두 가지 방법을 나란히 산출합니다. 하나는 널리 사용되는 대신 가정이 있고, 다른 하나는 그 가정을 사용하지 않습니다.
1. 기술반복을 평균 낸다
같은 시료의 같은 유전자에서 측정한 웰들을 평균합니다. 평균의 불확도는 표준오차, 즉 표준편차를 반복 수의 제곱근으로 나눈 값입니다.
- 평균 Ct
- Ct = ΣCtᵢ / n
- 평균의 표준오차
- u = s / √n
2. 참조유전자를 묶는다
참조유전자가 여러 개면 양(quantity)의 기하평균으로 묶습니다. 양은 E^−Ct에 비례하므로, 기하평균은 Ct 축에서 산술평균과 정확히 같은 계산이 됩니다. 두 방법이 어긋나지 않는 이유가 여기에 있습니다.
- 참조 Ct
- Ct_ref = ΣCt_i / m
3. 두 번 뺀다
표적에서 참조를 빼고(ΔCt), 거기서 대조군의 ΔCt를 뺍니다(ΔΔCt). 오차는 독립인 두 평균의 차에 대한 전파식으로 계산합니다.
- ΔCt
- ΔCt = Ct_표적 − Ct_ref
- ΔΔCt
- ΔΔCt = ΔCt_시료 − ΔCt_대조군
- 배수
- 2^−ΔΔCt
- 오차 전파
- u(A − B) = √(u(A)² + u(B)²)
4. 효율을 보정한다 (Pfaffl)
Pfaffl의 식은 증폭 효율이 2라는 가정을 사용하지 않습니다. 효율을 100 %로 두면 위의 2^−ΔΔCt와 동일한 식이 됩니다.
- 비율
- R = E_표적^ΔCP_표적 / E_ref^ΔCP_ref
- ΔCP
- 대조군 Ct − 시료 Ct
- 효율 → 밑
- E = 1 + 효율(%) / 100
주의사항
- 2^−ΔΔCt는 표적과 참조의 증폭 효율이 모두 정확히 2라고 가정합니다. Pfaffl은 원 논문에서 그 가정을 두고 「빠른 추정에만 사용할 수 있다」고 기술했습니다. 두 값을 나란히 제시하는 것은 그 가정의 영향을 직접 확인할 수 있게 하기 위해서입니다.
- 참조유전자는 3개 이상이 권장됩니다(Vandesompele 등, 2002). 하나만 사용하면 그 유전자가 처리에 반응할 때 결과 전체가 편향되며, 이를 감지할 방법이 없습니다.
- 기술반복과 생물반복은 서로 다른 것을 측정합니다. 한 접시에서 세 웰을 취한 것은 피펫팅의 균일성을, 세 접시를 각각 취한 것은 생물학적 차이를 나타냅니다. 이 도구는 둘을 끝까지 구분하고 오차막대가 어느 쪽에서 산출되었는지 표에 표시합니다.
- 오차는 표준오차를 전파한 값이지 신뢰구간이 아닙니다. 유의성 판정에는 사용할 수 없습니다.
- 대조군의 배수는 계산 결과가 1인 것이 아니라 정의상 1입니다. 그래서 오차막대를 표시하지 않고, 대신 대조군 자체의 ΔCt 산포를 별도로 표시합니다.
- 증폭되지 않은(Undetermined) 웰은 0이 아닙니다. 0으로 입력하면 그 시료가 가장 높게 발현한 것처럼 계산되므로, 이 도구는 해당 행을 평균에서 제외하고 그 개수를 안내합니다.
자주 묻는 질문
효율을 측정하지 않았다면 2^−ΔΔCt를 사용하고, 그 가정을 논문에 기재하면 됩니다. 표준곡선으로 효율을 측정했다면 Pfaffl 쪽이 그 측정값을 실제로 반영합니다. 두 값이 크게 벌어진다면 그 자체가 효율을 확인하라는 신호입니다.
양(quantity)의 기하평균으로 묶습니다. 다만 양은 E^−Ct에 비례하므로, 효율이 모두 같다면 그 기하평균은 Ct 값들의 산술평균과 정확히 일치합니다. 화면의 참조 Ct가 단순 평균으로 보이는 이유가 그것이며, 근사가 아닙니다.
시료 하나가 각각 하나의 그룹이 됩니다. 계산은 정상적으로 수행되지만 생물반복이 없으므로 오차막대는 기술반복에서만 산출됩니다. 표와 화면에 「기술반복」으로 표시됩니다.
숫자로 취급하지 않고 평균에서 제외합니다. 제외한 개수는 입력칸 아래에 표시됩니다. 40 같은 임의의 값으로 대체하는 방식은 사용하지 않습니다. 그 수치는 측정된 것이 아니라 임의로 정한 것이며, 결과를 조용히 바꾸기 때문입니다.
표준오차이므로 「평균 ± SEM」으로 기재할 수 있습니다. 다만 신뢰구간도 유의성 검정도 아닙니다. 검정이 필요하면 군별 배수를 통계 도구로 옮기세요.
참고문헌
이 도구의 식이 어디서 왔는지입니다. 서지사항은 Crossref 기록에서 확인했습니다.
- Pfaffl MW. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29(9):e45.doi:10.1093/nar/29.9.e45효율 보정식(Pfaffl 법)과, 비교 Ct 법(2^−ΔΔCt)이 「표적과 참조의 효율이 모두 2」를 전제한다는 문장
- Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. (2002) Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol 3(7):research0034.doi:10.1186/gb-2002-3-7-research0034참조유전자 여럿을 산술평균이 아니라 기하평균으로 묶는 근거
Livak & Schmittgen (2001)과 Applied Biosystems User Bulletin No. 2는 원문을 확인하지 못해 인용하지 않습니다. 2^−ΔΔCt는 Pfaffl 논문에 기재된 형태로 인용합니다.