2^−ΔΔCt와 Pfaffl 중 어느 값을 써야 하나요?

효율을 재지 않았다면 2^−ΔΔCt를 쓰고, 그 가정을 논문에 적으면 됩니다. 표준곡선으로 효율을 쟀다면 Pfaffl 쪽이 그 측정을 실제로 사용하는 값입니다. 두 값이 크게 갈라진다면 그것 자체가 효율을 확인해 보라는 신호입니다.

참조유전자를 여러 개 고르면 어떻게 묶이나요?

양(quantity)의 기하평균으로 묶습니다. 다만 양은 E^−Ct에 비례하기 때문에, 효율이 모두 같다면 그 기하평균은 Ct 값들의 산술평균과 정확히 같아집니다. 화면의 참조 Ct가 단순 평균으로 보이는 것은 그 때문이고, 어림이 아닙니다.

시료 하나가 각각 하나의 그룹이 됩니다. 계산은 그대로 되지만 생물반복이 없으므로 오차막대는 기술반복에서만 나옵니다. 표와 화면에 「기술반복」이라고 적힙니다.

숫자로 취급하지 않고 평균에서 뺍니다. 몇 개를 뺐는지는 입력칸 아래에 표시됩니다. 40 같은 임의의 값으로 채우는 방식은 쓰지 않습니다 — 그 숫자는 측정된 것이 아니라 정한 것이고, 결과를 조용히 바꿉니다.

표준오차이므로 「평균 ± SEM」으로 적을 수 있습니다. 다만 신뢰구간도 아니고 유의성 검정도 아닙니다. 검정이 필요하면 군별 배수를 통계 도구로 옮겨 주세요.

qPCR Ct 값에서 대조군 대비 발현 배수를 계산합니다.Ct 표를 붙여 넣고 아래에서 참조유전자와 대조군을 고르세요.

Ct 표

한 줄에 한 웰씩, 「시료 ⇥ 유전자 ⇥ Ct ⇥ 그룹(선택)」 순서입니다. 장비가 낸 표에서 시료·타깃·Cq 세 열을 그대로 복사해 붙여 넣으면 읽힙니다.

같은 시료의 같은 유전자가 여러 줄이면 기술반복으로 평균 냅니다. 네 번째 칸에 그룹 이름을 적으면 그 그룹 안의 서로 다른 시료가 생물반복이 됩니다. 두 반복은 끝까지 갈라서 계산합니다.

두 가지 방법을 나란히 냅니다. 하나는 널리 쓰이는 대신 가정이 있고, 다른 하나는 그 가정을 쓰지 않습니다.

같은 시료의 같은 유전자에서 나온 웰들을 평균 냅니다. 평균의 불확실도는 표준오차, 즉 표준편차를 반복 수의 제곱근으로 나눈 값입니다.

참조유전자가 여러 개면 양(quantity)의 기하평균으로 묶습니다. 양은 E^−Ct에 비례하므로, 기하평균은 Ct 축에서 산술평균과 정확히 같은 계산이 됩니다. 두 방법이 어긋나지 않는 이유가 여기에 있습니다.

표적에서 참조를 빼고(ΔCt), 거기서 대조군의 ΔCt를 뺍니다(ΔΔCt). 오차는 독립인 두 평균의 차에 대한 전파식으로 따라갑니다.

Pfaffl의 식은 증폭 효율이 2라는 가정을 쓰지 않습니다. 효율을 100 %로 두면 위의 2^−ΔΔCt와 같은 식이 됩니다.

2^−ΔΔCt는 표적과 참조의 증폭 효율이 모두 정확히 2라고 가정합니다. Pfaffl은 원 논문에서 그 가정을 두고 「빠른 추정에만 쓸 수 있다」고 적었습니다. 두 값을 나란히 두는 것은 그 가정의 크기를 눈으로 보이게 하려는 것입니다.
참조유전자는 세 개부터 권장됩니다(Vandesompele 등, 2002). 하나만 쓰면 그 유전자가 처리에 반응할 때 결과가 통째로 기울고, 그것을 알아챌 방법이 없습니다.
기술반복과 생물반복은 다른 것을 잽니다. 한 접시에서 세 웰을 뜬 것은 피펫팅이 얼마나 고른지를, 세 접시를 각각 뜬 것은 생물학적 차이를 말합니다. 이 도구는 둘을 끝까지 갈라 놓고 오차막대가 어느 쪽에서 나왔는지 표에 적습니다.
오차는 표준오차를 전파한 값이지 신뢰구간이 아닙니다. 유의성 판정에는 쓸 수 없습니다.
대조군의 배수는 계산해서 1이 된 것이 아니라 정의상 1입니다. 그래서 오차막대를 그리지 않고, 대신 대조군 자체의 ΔCt 흩어짐을 따로 보여 줍니다.
증폭되지 않은(Undetermined) 웰은 0이 아닙니다. 0으로 넣으면 그 시료가 가장 많이 발현한 것처럼 계산되므로, 이 도구는 그런 줄을 평균에서 빼고 몇 개였는지 알려 줍니다.