사용 방법
- ImageJ에서 표적 밴드와 로딩 컨트롤 밴드의 밝기를 측정합니다. 배경은 이 단계에서 미리 차감해 주세요.
- 레인 이름·표적 밝기·로딩 컨트롤 밝기를 한 행씩 붙여넣습니다.
- 반복을 묶으려면 네 번째 칸에 그룹 이름을 함께 입력합니다.
- 대조군을 선택합니다. 모든 배수가 이 그룹의 평균을 1로 두고 계산됩니다.
- 표의 1단계 칸과 2단계 칸을 함께 확인하세요. 옆의 「보정 없이」 칸은 1단계를 생략했을 때의 값입니다.
공식과 주의사항
계산은 나눗셈 두 번입니다. 어려운 것은 계산이 아니라 순서입니다.
1단계 — 레인마다 자기 로딩 컨트롤로 나눈다
레인마다 로딩량이 다르므로, 표적 밝기를 해당 레인의 로딩 컨트롤 밝기로 나눕니다. 이 값은 「동일한 양을 로딩했다면 얼마였을까」에 해당합니다.
- 정규화값
- 표적 ÷ 로딩 컨트롤
2단계 — 대조군 평균으로 나눈다
1단계 값을 대조군 레인들의 1단계 평균으로 나눕니다. 대조군이 1이 되고 나머지가 그에 대한 배수가 됩니다.
- 배수
- 정규화값 ÷ 대조군 정규화값 평균
주의사항
- 출처는 두 단계를 「표적 × (대조군 로딩 ÷ 해당 레인 로딩)」으로 기술합니다. 이 도구는 「표적 ÷ 해당 레인 로딩」으로 계산합니다. 두 식은 대조군 로딩이라는 상수 하나만큼 다르며, 그 상수는 2단계에서 모든 레인에 동일하게 나뉘어 소거되므로 최종 배수는 완전히 동일합니다.
- 밝기는 배경을 차감한 값이어야 하며, 포화되지 않은 이미지에서 측정해야 합니다. 포화된 밴드는 실제보다 작은 차이를 나타냅니다.
- 로딩 컨트롤의 산포는 CV로 제시하지만 합격·불합격 기준은 제시하지 않습니다. 1차 문헌에서 그 기준값을 확보하지 못했고, 근거 없는 수치를 기준선처럼 두지 않는 것이 이 사이트의 방침입니다.
- 하우스키핑 단백질은 레인당 약 4 μg을 초과하면 막이 포화되는 경우가 많습니다(Taylor & Posch, 2014). 로딩 컨트롤이 포화되면 로딩량이 달라도 밝기가 동일하게 보여, 정규화가 오히려 차이를 지웁니다.
- 「보정 없이」 칸은 참고용이며 보고에 사용하는 값이 아닙니다. 1단계를 생략하면 얼마나 달라지는지 보여 주기 위해 둔 것입니다.
자주 묻는 질문
달라집니다. 먼저 대조군으로 나누고 나중에 로딩으로 나누면 레인마다 다른 상수로 나누는 셈이 되어 값이 달라집니다. 표의 「보정 없이」 칸이 1단계를 생략했을 때의 값이므로, 두 칸을 비교하면 그 크기를 바로 확인할 수 있습니다.
가능합니다. 계산은 동일하며, 세 번째 칸에 총단백질 신호를 입력하시면 됩니다. 총단백질 쪽이 하우스키핑 단백질보다 포화 문제에서 자유롭다고 보고되어 있습니다.
해당 레인들의 1단계 값을 평균해 기준으로 사용합니다. 그래서 대조군 레인 각각의 배수는 정확히 1이 아니라 1 부근에 분포하며, 그 산포가 곧 이 실험의 재현성입니다.
배경이 남아 있으면 약한 밴드일수록 상대적으로 더 과대평가됩니다. 이 도구는 배경 차감 여부를 판별할 수 없습니다. ImageJ에서 먼저 차감해 주세요.