配列解析
プライマー Tm値 計算ツール
プライマーの融解温度 (Tm) を求めます。
例が入っています。入力欄をクリックすると消えます。
例
計算結果 — 2 配列
| 名前 | 配列 | 長さ | GC% | Tm (°C) | 概算 (Wallace) | ΔH (kcal/mol) | ΔS (cal/mol·K) | 分子量 | ε₂₆₀ |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| FWD_GAPDH | ACCACAGTCCATGCCATCAC | 20 | 55.0% | 62.2 | 62 | -154.6 | -414.8 | 5991 | 187,700 |
| REV_GAPDH | TCCACCACCCTGTTGCTGTA | 20 | 55.0% | 63.0 | 62 | -152.2 | -406.6 | 6004 | 176,600 |
これらは予測値です。実際の融解温度は配列・緩衝液・測定方法によって変わりますので、重要な場面では実験で確かめてください。
SantaLucia (1998) の nearest neighbor法 のパラメータと、同じ論文の塩補正を ΔS に適用しています。dNTP にキレートされたあとに残る Mg²⁺ は、一価イオン換算濃度として組み込んでいます (von Ahsen 2001)。概算 (Wallace) の列は 2(A+T)+4(G+C) で、短いプライマーの目安です。判断は Tm の列で行ってください。
参考文献
このツールの式の出どころです。すべての項目を PubMed または DOI の記録と照合しました。
- SantaLucia J Jr. (1998) A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci USA 95(4):1460–1465.doi:10.1073/pnas.95.4.1460nearest neighbor法 のパラメータと塩補正 — このツールが使う2つは、どちらもこの1本の論文から来ています
- von Ahsen N, Wittwer CT, Schütz E. (2001) Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas. Clin Chem 47(11):1956–1961.doi:10.1093/clinchem/47.11.1956Mg²⁺ と dNTP を一価イオン換算濃度に直す関係式
- von Ahsen N, Wittwer CT, Schütz E. (2011) Monovalent and divalent salt correction algorithms for Tm prediction — recommendations for Primer3 usage. Brief Bioinform 12(5):514–517.doi:10.1093/bib/bbq081一価と二価の補正をどう組み合わせるかの根拠
- Green MR, Sambrook J. (2019) Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harb Protoc 2019(6):pdb.top095109.doi:10.1101/pdb.top095109標準的な PCR プリセットの4つの値 — KCl 50 mM・Mg²⁺ 1.5 mM・各 dNTP 200 µM・プライマー 0.1〜0.5 µM
- Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. (1979) Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res 6(11):3543–3557.doi:10.1093/nar/6.11.3543概算の列の基になっている 2(A+T) + 4(G+C) の規則
ε₂₆₀ の列の基になっているジヌクレオチドの表は、載せていません。1次記録で出典を確認できなかったためです。分子量は塩基の重量の総和であり、引用を必要としません。
使い方ガイド
- プライマーを 1 行に 1 本ずつ、または FASTA でまとめて入れます。ファイルのドロップも使えます。
- オリゴ濃度と塩濃度を設定します。Na⁺・Mg²⁺・dNTP はいずれも値を変えます。既定値は出発点であって、あなたのバッファーではありません。
- 表を読みます。各行が自分の値に使われた条件を示すので、どの設定で計算されたか迷わずに 2 本を比べられます。
知っておくとよいこと
- モデルは SantaLucia (1998) の nearest-neighbor パラメータで、同じ論文の塩補正を ΔS に適用しています。補正には dNTP がキレートしたあとに残るマグネシウムを使います。
- これは予測値です。実際の融解温度は配列・バッファー・測定方法で変わるので、重要な場面では実験で確認してください。
- A・C・G・T 以外の文字は黙って消さず、数えて報告します。1 文字抜けるとそれ以降の位置がすべて変わるからです。
よくある質問
ほとんどの場合は塩補正かオリゴ濃度です。補正の異なる 2 つのツールは同じ配列でも違う値を出します。だからこのツールはどのモデルを使ったかを明記しています。
反応中のプライマー濃度です。分注もとのストック濃度ではありません。
計算に使うのは明確な塩基だけです。それ以外は取り除いて報告するので、数値を信じる前に何が外れたか確認できます。
ほかの配列ツール
- DNA 逆相補的配列 — 塩基配列の反転・相補・逆相補を求めます。
- GC 含量計算ツール — GC・AT 含量とスキュー、位置ごとの GC 含量を見ます。
- マルチプルアライメント — 近縁の配列を並べて、保存領域を読み取ります。