配列解析
プライマーダイマー確認ツール
プライマーのセットが自己ダイマーをつくるか、どこで結合するか、そしてポリメラーゼが伸長できるかを示します。
例のプライマーペアです。入力を始めると置き換わります。
例:
プライマー 2 本、組み合わせ 3 通り
| 組み合わせ | 種類 | ΔG (kcal/mol) | 3′ ΔG | 3′ 塩基数 |
|---|---|---|---|---|
| FWD_GAPDH | Self | -1.86 | 0.79 | 2 / 2 |
| REV_GAPDH | Self | -0.30 | 1.46 | 2 / 2 |
| FWD_GAPDH × REV_GAPDH | Cross | -2.20 | 0.54 | 2 / 1 |
ΔG は 37 °C・1 M Na⁺ での値、SantaLucia (1998)。負であれば二本鎖ができうるという意味です。⚠️ ミスマッチとループは計算に含まれません。そのためここの値は実際より負に出ます。
FWD_GAPDH
Self3′ 末端がここにかかります — ポリメラーゼが伸長できます
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'
|| || ||
3'- CACTACCGTACCTGACACCA-5'ΔG 0.79 kcal/mol · 塩基対 6 · 最長連続 2 · 3′ 末端のかかり 2 と 2
最も安定な配置
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'
| |||| |
3'- CACTACCGTACCTGACACCA-5'ΔG -1.86 kcal/mol · 塩基対 6 · 最長連続 4 · 3′ 末端のかかり 0 と 0
REV_GAPDH
Self3′ 末端がここにかかります — ポリメラーゼが伸長できます
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3'
||
3'- ATGTCGTTGTCCCACCACCT-5'ΔG 1.46 kcal/mol · 塩基対 2 · 最長連続 2 · 3′ 末端のかかり 2 と 2
最も安定な配置
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3'
| || |
3'- ATGTCGTTGTCCCACCACCT-5'ΔG -0.30 kcal/mol · 塩基対 4 · 最長連続 2 · 3′ 末端のかかり 1 と 1
FWD_GAPDH × REV_GAPDH
Cross3′ 末端がここにかかります — ポリメラーゼが伸長できます
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'
| | ||
3'- ATGTCGTTGTCCCACCACCT-5'ΔG 0.54 kcal/mol · 塩基対 4 · 最長連続 2 · 3′ 末端のかかり 2 と 1
最も安定な配置
5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
| |||| |
3'-ATGTCGTTGTCCCACCACCT -5'ΔG -2.20 kcal/mol · 塩基対 6 · 最長連続 4 · 3′ 末端のかかり 0 と 0
使い方ガイド
- プライマーのセットを貼り付けます — FASTA で 1 本につき 1 レコード、または配列ひとつだけ。最大 12 本です。
- すべてのプライマーを自分自身と、そして他のすべてと突き合わせます。4 本入れれば自己ダイマー 4 通りと組み合わせ 6 通りになります。
- 表の「3′ 列」を先に見てください。ポリメラーゼが伸長できる配置であり、遅い反応を「競合する産物」に変えるのがそれです。
- 下の図がどの塩基がどこに結合しているかを示します。設計し直すときに必要なのはそれで、たいていは 3′ 末端の 1 塩基をずらすだけで足ります。
知っておくこと
- ΔG は 37 °C・1 M Na⁺ 基準です。nearest neighbor パラメータがその状態で示されているからで、お使いのバッファーには補正しません。粗いモデルから出た数値を補正すると、実際より正確に見えてしまいます。
- ΔG が負なら二本鎖ができ得て、より負であるほど平衡でより多くできます。⛔ このツールは「しきい値」を出しません。意味のあるしきい値は、プライマー濃度・アニーリング温度・チューブの中身によって変わるからです。
- ⚠️ このモデルにはミスマッチ・バルジ・ループのパラメータがありません。結合した二つの区間のあいだの隙間に費用がかからないため、値は実際より負に出ます。外れるならこの向きのほうが妥当です — 判定ではなく確認する一覧をお渡ししているからです。
- プライマーのどこであれ結合すれば反応は遅くなります。3′ 末端がかかったものは「別の出来事」で、そこからさらに 2 つに分かれます。3′ 末端の「先」に相手鎖が残っていればポリメラーゼがそれを写して伸長し、できた産物が残りのサイクルのあいだプライマー・dNTP・ポリメラーゼを奪い合います。両端がぴったり揃っていれば写すものがなく伸長は起きませんが、その分プライマーは鋳型へ行けません。⛔ 前者は 3′ 末端を 1〜2 塩基ずらせばたいてい解けますが、後者は設計し直しです。
- 自己ダイマーも交差ダイマーと同じだけ見る価値があります。プライマーは 200〜500 nM で入るので、鋳型よりも「自分自身」に会う回数のほうがずっと多いのです。
- これらのプライマーの融解温度は別の問いで、プライマー Tm値 計算ツールが実際のバッファーで答えます。
よくある質問
このツールはその数値をお渡ししませんし、渡すと称するものがあればそれは作り話です。どこからが過剰かは、チューブにプライマーがどれだけ入っているか・アニーリング温度が何度か・何サイクル回すかで変わります。表は「比べる」ためのものです — 自分のセットの中の組み合わせ同士で、そしてプライマーが鋳型と作る「はず」の二本鎖（数十 kcal/mol）と。
それが産物になるからです。プライマーの「途中」で結合しても互いを引き止めるだけですが、3′ 末端が結合するとポリメラーゼに出発点を与えます。そうしてできたものが残りのサイクルのあいだ、あらゆる試薬を奪い合います。しかも最も安定な配置がそれで「ない」ことはよくあります — このページの 3 つ目の例では、最も安定なのは両端が入っていない 12 塩基の二本鎖で、肝心なのは 4 塩基のほうです。
そこで結合するものが、結合を保つには小さすぎるという意味です。らせんを「始める」のに自由エネルギーがかかり、A・T の 2 対が返すものはその費用より少ないのです。正が正直な答えなので隠さず画面に残します —「この 2 本にできる最悪が何でもない」ことは読む価値があります。
ツールごとにパラメータ表も前提も違います。こちらは SantaLucia (1998)・1 M Na⁺・ミスマッチ項なしで、そう「書いてあります」。別のツールは古い表を使ったり、塩補正をしたり、バルジを許す探索をしたりします。2 つのツールの数値は「それぞれのツールの中で」比べられるもので、互いに比べられるものではありません — このページが数値だけでなく「二本鎖の図」も見せる理由でもあります。
100 塩基までは入ります。ただしこのモデルはプライマーが作る「短い」二本鎖のために作られたものです。長いオリゴは自分で折りたたみ、折りたたみは 2 本の鎖をずらして合わせるのとは別の計算です。
ほかの配列ツール
- プライマー Tm値 計算ツール — nearest neighbor法 による融解温度
- DNA 逆相補的配列 — 塩基配列の反転・相補・逆相補を求めます。
- GC 含量計算ツール — GC・AT 含量とスキュー、位置ごとの GC 含量を見ます。