Análisis de secuencias
Comprobación de dímeros de cebadores
Indica si un conjunto de cebadores forma autodímeros, dónde se aparean y si una polimerasa puede extender desde ahí.
Un par de cebadores de ejemplo. Se sustituye en cuanto escribas.
Ejemplos:
2 cebadores, 3 combinaciones
| Combinación | Tipo | ΔG (kcal/mol) | ΔG en 3′ | Bases en 3′ |
|---|---|---|---|---|
| FWD_GAPDH | Self | -1.86 | 0.79 | 2 / 2 |
| REV_GAPDH | Self | -0.30 | 1.46 | 2 / 2 |
| FWD_GAPDH × REV_GAPDH | Cross | -2.20 | 0.54 | 2 / 1 |
El ΔG es a 37 °C y 1 M Na⁺, SantaLucia (1998). Un valor negativo significa que el dúplex puede formarse. ⚠️ Los desapareamientos y los bucles no entran en el cálculo, así que estos valores salen más negativos que los reales.
FWD_GAPDH
SelfEl extremo 3′ entra en este — una polimerasa puede extenderlo
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'
|| || ||
3'- CACTACCGTACCTGACACCA-5'ΔG 0.79 kcal/mol · 6 pares de bases · tramo más largo 2 · extremos 3′ cubiertos 2 y 2
El registro más estable
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'
| |||| |
3'- CACTACCGTACCTGACACCA-5'ΔG -1.86 kcal/mol · 6 pares de bases · tramo más largo 4 · extremos 3′ cubiertos 0 y 0
REV_GAPDH
SelfEl extremo 3′ entra en este — una polimerasa puede extenderlo
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3'
||
3'- ATGTCGTTGTCCCACCACCT-5'ΔG 1.46 kcal/mol · 2 pares de bases · tramo más largo 2 · extremos 3′ cubiertos 2 y 2
El registro más estable
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3'
| || |
3'- ATGTCGTTGTCCCACCACCT-5'ΔG -0.30 kcal/mol · 4 pares de bases · tramo más largo 2 · extremos 3′ cubiertos 1 y 1
FWD_GAPDH × REV_GAPDH
CrossEl extremo 3′ entra en este — una polimerasa puede extenderlo
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'
| | ||
3'- ATGTCGTTGTCCCACCACCT-5'ΔG 0.54 kcal/mol · 4 pares de bases · tramo más largo 2 · extremos 3′ cubiertos 2 y 1
El registro más estable
5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
| |||| |
3'-ATGTCGTTGTCCCACCACCT -5'ΔG -2.20 kcal/mol · 6 pares de bases · tramo más largo 4 · extremos 3′ cubiertos 0 y 0
Cómo se usa
- Pega el conjunto de cebadores: un registro por cebador en FASTA, o una sola secuencia. Hasta doce.
- Cada cebador se compara consigo mismo y con todos los demás, así que un conjunto de cuatro da cuatro autodímeros y seis combinaciones.
- Mira primero la columna 3′ de la tabla. Ese es el registro que una polimerasa puede extender, y el que convierte una reacción lenta en un producto que compite.
- Los dibujos de abajo muestran qué bases están pegadas a cuáles, que es lo que hace falta para rediseñar: mover una sola base del extremo 3′ suele bastar.
Qué conviene saber
- El ΔG es a 37 °C y 1 M de Na⁺, el estado de referencia en el que están dados los parámetros del vecino más próximo. No se corrige por tu amortiguador, y corregirlo haría que un número salido de un modelo tosco pareciera exacto.
- Un ΔG negativo significa que el dúplex puede formarse, y cuanto más negativo, más hay en el equilibrio. ⛔ Esta herramienta no te dará un umbral, porque el que importa depende de la concentración de cebador, de la temperatura de hibridación y de qué más haya en el tubo.
- ⚠️ El modelo no tiene parámetros de desapareamiento, de abultamiento ni de bucle. Un hueco entre dos tramos apareados no cuesta nada aquí, así que los valores resultan más negativos que los reales. Si ha de equivocarse, esa es la mejor dirección: esto es una lista para revisar, no un veredicto.
- Un dúplex en cualquier punto de dos cebadores ralentiza la reacción. Uno que cubre un extremo 3′ es otra cosa, y a su vez se divide en dos. Si la hebra compañera lleva bases más allá de ese extremo 3′, la polimerasa las copia, y el producto compite después por cebador, dNTP y polimerasa durante el resto de la carrera. Si los dos extremos quedan a ras no hay nada que copiar y no se extiende nada, pero el cebador tampoco va a un molde. ⛔ Lo primero suele resolverse moviendo una o dos bases del extremo 3′; lo segundo pide un rediseño.
- Los autodímeros merecen tanta atención como los cruzados. Un cebador está a 200–500 nM y se encuentra con otra copia de sí mismo mucho más a menudo que con el molde.
- La temperatura de fusión de estos cebadores es otra pregunta, y la calculadora de Tm de cebadores la responde con tu amortiguador real.
Preguntas frecuentes
No hay un número que esta herramienta vaya a darte, y una que dijera tenerlo se lo estaría inventando. Cuánto es demasiado depende de cuánto cebador hay en el tubo, de la temperatura de hibridación y de cuántos ciclos se corren. La tabla está para comparar: entre las combinaciones de tu propio conjunto, y frente al dúplex que el cebador debería formar con el molde, que son decenas de kcal/mol.
Porque es el que se convierte en producto. Unas bases pegadas en medio de dos cebadores solo los retienen; unas bases pegadas en un extremo 3′ le dan a la polimerasa por dónde empezar, y lo que fabrica compite luego por todos los reactivos durante el resto de la carrera. Y el registro más estable a menudo no es ese: en el tercer ejemplo de esta página es un dúplex de doce bases sin ningún extremo dentro, mientras que el que importa mide cuatro.
Que lo único que se empareja ahí es demasiado pequeño para sostenerse. Iniciar una hélice cuesta energía libre, y dos pares de A y T devuelven menos de lo que costó empezarla. Un número positivo es la respuesta honesta y se deja en pantalla en vez de ocultarse, porque «lo peor que pueden hacerse estos dos es nada» merece leerse.
Cada herramienta usa tablas de parámetros y supuestos distintos. Esta es SantaLucia (1998) a 1 M de Na⁺ y sin términos de desapareamiento, y lo dice. Otra puede usar una tabla más antigua, aplicar una corrección de sal o permitir abultamientos en la búsqueda. Los números de dos herramientas se comparan dentro de cada una, no entre ellas, y por eso esta página muestra el dúplex y no solo la cifra.
Hasta cien bases, pero el modelo se hizo para los dúplex cortos que forman los cebadores. Un oligo largo se pliega, y plegarse es un cálculo distinto de deslizar dos hebras una sobre otra.
Las otras herramientas de secuencias
- Calculadora de Tm de cebadores — Temperatura de fusión por el modelo del vecino más próximo
- Complemento inverso de ADN — Invierte, complementa o calcula el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos.
- Calculadora de contenido de GC — Contenido de GC y AT, sesgo, y GC a lo largo de la secuencia.