使い方ガイド
- 使うポリメラーゼを選びます。⚠️ 温度は酵素ごとに「違います」— ここにある Taq 系の 2 つでも、伸長が 68 °C のものと 65 °C のものがあります。
- アンプリコン全体の長さを bp で入力します。ここから計算されるのは伸長時間だけで、ほかの行はプロトコルの値そのままです。
- 表をそのままサーマルサイクラーに入力します。色の付いた 3 行が繰り返す区間で、横の「×」がサイクル数です。
- アニーリング温度は「範囲」でのみ出ます。そのセルの「Tm 計算機」リンクから、プライマーで直接求めてください。
💡 表の下のリンクは、その値を書き写したメーカーのプロトコル原文です。うまくいかないときはまずそこを見てください。
計算式と注意点
この道具が「計算」するのは伸長時間ひとつだけです。ほかの行はメーカーが印刷した値をそのまま写しています。
伸長時間
酵素ごとに決まった秒/kb にアンプリコン長を掛けます。サーマルサイクラーが整数秒で受け取るため切り上げます。
- 伸長時間
- t = (秒/kb) × (アンプリコン bp ÷ 1000)
⚠️ なぜ酵素ごとに表を分けるのか
ここに載せた 5 つの酵素の伸長温度は「3 通り」です — 72 °C・68 °C・65 °C。変性温度も 94・95・98 °C に分かれます。「だいたいこう」という 1 行を書くと 5 つのうち 3 つで間違いになります。そのため一般化せず、プロトコルをそのまま載せています。
⛔ アニーリング温度を 1 つに決めない理由
ここに載せた 5 つのプロトコルはすべて、メーカーの Tm 計算機を使うようにと本文に書いています。アニーリングはプライマー配列・塩濃度・緩衝液に依存するため、酵素だけでは決められません。そこでプロトコルが印刷した範囲をそのまま示し、そのセルから Tm 計算機へ移動できるようにしています。
注意点
- ここにあるのは「ルーチン PCR」の条件です。GC が高い、二次構造が強い、鋳型が非常に少ない、アンプリコンが非常に長いといった場合は、プロトコル本文が追加の最適化を案内しています — リンクから確認してください。
- アンプリコン長は両方のプライマーの「外側の端まで」測ってください。プライマー間の距離だけを測ると、伸長時間が短く出ます。
- プロトコルを直接開いていない酵素は載せていません。開かずに書いた値は、画面上では出典のある値と見分けがつきません。
- ホットスタート版は初期変性の条件が異なることがあります。実際にお使いの製品のプロトコルを確認してください。
よくある質問
酵素ごとに最適温度が違うためです。ここにある 5 つだけでも、Q5 と Phusion は 72 °C、標準 Taq と OneTaq は 68 °C、LongAmp は 65 °C です。「PCR の伸長は 72 °C」は広く使われる覚え方ですが、5 つのうち 3 つで誤りになります。この道具が最初に酵素を尋ねるのはそのためです。
酵素だけでは決められないためです。アニーリング温度はプライマーの配列と長さ、塩濃度、緩衝液に依存し、ここにある 5 つのプロトコルはすべてメーカーの Tm 計算機を使うようにと本文に書いています。この道具はプロトコルが印刷した「範囲」を示し、そのセルからプライマー Tm の道具へ移動できるようにしています。
フォワードプライマーの 5′ 末端からリバースプライマーの 5′ 末端まで、つまり実際に作られる産物全体です。プライマーの間だけを測るとプライマーの長さ分が抜け、その分だけ伸長時間が足りなくなります。アンプリコンが短いほど、この差は比率として大きくなります。
プロトコルが範囲で印刷しているためです。鋳型が多ければ少ないほう、コピー数の低い標的なら多いほうを使います。ただしサイクルを増やすほど非特異産物やエラーも増えるため、バンドが見える最小のサイクル数を使うほうがよいでしょう。