Cómo se usa
- Elige la polimerasa que vas a usar. ⚠️ Las temperaturas cambian con la enzima: incluso dos enzimas de la familia Taq recogidas aquí extienden a 68 °C y a 65 °C.
- Escribe la longitud completa del amplicón en bp. De ahí solo sale el tiempo de extensión; las demás filas son los valores del propio protocolo.
- Programa la tabla en el termociclador. Las tres filas sombreadas son el bloque que se repite, y el × que llevan al lado es el número de ciclos.
- La temperatura de hibridación se da como un intervalo. Sigue el enlace a la calculadora de Tm de esa celda y dedúcela de tus cebadores.
💡 El enlace bajo la tabla lleva al protocolo del fabricante del que salen estos valores. Si la reacción se resiste, empieza por ahí.
Fórmula y precauciones
Aquí solo se calcula un número: el tiempo de extensión. Las demás filas son los valores impresos por el fabricante, trasladados sin cambios.
Tiempo de extensión
Los segundos por kilobase de la enzima, por la longitud del amplicón. Se redondea hacia arriba porque el termociclador trabaja en segundos enteros.
- Extensión
- t = (s/kb) × (amplicón bp ÷ 1000)
⚠️ Por qué hay una tabla por enzima
Los cinco protocolos recogidos aquí llevan tres temperaturas de extensión distintas — 72 °C, 68 °C y 65 °C — y tres de desnaturalización, 94, 95 y 98 °C. Una sola línea del tipo «normalmente es así» sería falsa para tres de los cinco, de modo que no se generaliza nada y los protocolos se recogen tal como están impresos.
⛔ Por qué no se propone una temperatura de hibridación
Los cinco protocolos dicen en su propio texto que se use la calculadora de Tm del fabricante. La hibridación depende de las secuencias de los cebadores, de la sal y de la disolución amortiguadora, así que la enzima por sí sola no la fija. Se muestra el intervalo que imprime cada protocolo, con un enlace desde esa celda a la herramienta de Tm de cebadores.
Precauciones
- Estas son condiciones de PCR rutinaria. Un GC alto, una estructura secundaria marcada, muy poco molde o amplicones muy largos piden optimización adicional, y el texto del protocolo explica cómo: sigue el enlace.
- Mide el amplicón hasta los extremos exteriores de ambos cebadores. Medir solo el hueco entre ellos deja el tiempo de extensión corto.
- Las enzimas cuyos protocolos no se abrieron no están. Un valor escrito aquí sin leer su protocolo sería indistinguible en pantalla de uno con fuente.
- Las versiones hot start pueden tener otra desnaturalización inicial. Consulta el protocolo del producto que tengas realmente.
Preguntas frecuentes
Se usan a menudo juntas
Calculadora de master mix
Cuánto hace falta de cada componente para varias reacciones. El agua completa el resto.
Tm de cebadores
Temperatura de fusión de cebadores y oligonucleótidos por el modelo del vecino más próximo.
Diseñador de placas de PCR y master mix
Distribuye una placa de 96 pocillos y obtén los volúmenes de mezcla que le corresponden, en una sola página imprimible.